使用亲水相互作用色谱 与LC/MS/MS 分析胆碱代谢物

摘要:使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 和 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-OH5 色谱柱分析胆碱及其代谢物。与 Poroshell 120 HILIC-OH5 相比， Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱可提供更好的峰形和略高的灵敏度，但是保留性能较弱。本文使用 Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱考察不同流动相添加剂的影响。结果发现，在流动相中添加 10 mmol/L 乙酸铵可以获得峰形。

前言:胆碱及其代谢物甜菜碱、乙酰胆碱和甘油磷酰胆碱属于小分子强极性季胺化合物，无法在反相色谱柱上保留。新开发的 HILIC 化学键合相采用表面多孔颗粒填料技术，是保留这类化合物的理想选择。在本应用简报中，使用 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-OH5 和 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 化学键合相色谱柱对胆碱及其代谢物进行分离。使用 Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱考察不同流动相添加剂的影响。Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统用于低浓度样品的检测。

实验部分:试剂与化学品所有试剂均为 HPLC 级或更高等级。 HPLC 级乙腈购自 J. T. Baker (Center Valley, PA, USA)。水经由 ELGA PURELAB Chorus 系统 (High Wycombe, UK) 纯化。甲酸、乙酸、乙酸铵和氢氧化铵购自北京百灵威科技有限公司。胆碱、甜菜碱、乙酰胆碱和甘油磷酰胆碱购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。标准溶液用 90:10 乙腈:水溶液配制而成，浓度为 0.5 nmol/L。

仪器与材料 • 色谱柱入口：Agilent InfinityLab Quick Connect 快速连接液相色谱接头（部件号 5067-5965） • 色谱柱出口：Agilent InfinityLab Quick Turn 液相色谱接头（部件号 5067-5966） • Agilent Captiva 经济型过滤器，PTFE 膜，直径 13 mm，孔径 0.2 µm（部件号 5190-5265） • 安捷伦样品瓶，螺口盖，棕色，带书写签，经认证，2 mL（部件号 5182- 0716） • 安捷伦固定螺口盖，蓝色，带 PTFE/ 红色硅胶隔垫（部件号 5190-7024） • Agilent InfinityLab 溶剂瓶，棕色， 1000 mL（部件号 9301-6526）Agilent InfinityLab Stay Safe 溶剂瓶安全盖，GL45，3 口，1 个放空阀（部件号 5043-1219） • Eppendorf 移液器和连续分液器 • 超声仪 (VWR, Radnor, PA, USA)

仪器 • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B) • Agilent 1290 Infinity II MCT (G7116B) • Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统 (G6460A) • Agilent MassHunter LC/MS 数据采集软件，版本 B.08.00 软件 Agilent MassHunter 定性分析软件，版本 B.07.00

结果与讨论:如图 2 所示，考察了不同的流动相添加剂。随着流动相 pH 值增加，乙酰胆碱和胆碱在 Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱上的保留能力增强，但是响应信号稍有降低。当使用中性或碱性流动相时，它们的保留能力保持不变。然而，在中性 pH 值流动相条件下，乙酰胆碱和甜菜碱的信号强度均比碱性条件下高。因此在流动相中添加 10 mmol/L 乙酸铵能够为四种化合物提供好的分离。

在相同中性 pH 值流动相的条件下，对比了两种 HILIC 色谱柱的分离效果。 Poroshell 120 HILIC-OH5 色谱柱的分析结果显示所有化合物的保留性能均有所增强，出峰顺序发生改变，甜菜碱的灵敏度提高。然而，Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱能够为关键分析物乙酰胆碱和胆碱提供更好的峰形。

结论总体来说，在中性 pH 值条件下使用添加乙酸铵的流动相以及 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱可以实现胆碱及其代谢物的分离。对另一种不同的 HILIC 化学键合相（即 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-OH5）也同样进行了分离性能的评估。甜菜碱的灵敏度在 HILIC-OH5 色谱柱上得到了提高，然而乙酰胆碱和胆碱的峰形和灵敏度在 HILIC-Z 色谱柱上更出色。