人参皂苷的 UHPLC 新方法的开发

摘要目的：使用带有自动方法开发/色谱柱筛选功能的超高效液相色谱 (UHPLC) 系统对于人参皂苷类成分的适宜分离条件进行快速筛选及探索，并在此基础上优化得到快速高效重现性良好的定性定量分析方法。方法：使用自动方法开发系统对分离条件进行筛选和优化后，得到两种基于不同选择性条件的最终方法，方法 1，色谱柱：Agilent Zorbax Bonus RP(3.0 x 50mm，1.8 µm)，柱温25 °C，流动相为超纯水(A)-乙腈(B)，梯度分析，流速1.0mL/min，检测波长 203 nm；方法 2，色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（3.0 x 150 mm，1.8 µm），柱温 50 °C，流动相为超纯水 (A)-乙腈 (B)，梯度分析，流速 0.6 mL/min，检测波长 203 nm。结果：使用上述两个方法对标准品和样品进行了分析，所需分析时间均小于 10 分钟，重现性良好，保留时间 RSD < 0.2%，峰面积 RSD < 1.0%，样品中的干扰成分与被测成分均可以得到良好分离。结论：两种方法分析快速切分离度良好，能够充分发挥 UHPLC 的分离能力，适合于含有人参皂苷类成分的药材及制剂的分析。Agilent 的方法筛选软件可以快速、无人照管地选择最佳的色谱柱、色谱条件；使方法开发的步骤更趋系统化，更为合理。

前言人参皂苷 (Ginsenoside) 是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。人参皂苷被视为是此类药材中的活性成分，具有增加白细胞数量、提高人体免疫力、促进物质代谢、抗疲劳、抗衰老等作用[1]，使用液相色谱方法分析此类成分是控制人参、三七等药材或含此类活性成分药品的重要手段，但是相关样品中的人参皂苷一般需要很长的分析时间，例如：中国药典的方法需要大概 90 至 120 分钟时间[2]。UHPLC 技术的出现可以使液相色谱分析时间大为缩短，在不损失分离度的情况下大幅提高分析速度，目前已经广泛应用于中药分析领域。在分析方法的开发过程中，通过改变色谱柱的种类，柱温等条件可以改变分离选择性，从而对较难分离的化合物进行更好的分析，在人参皂苷的分析中，Re 及 Rg1 是一对比较难分离的成分，通常需要比较长时间（大概 20 分钟[3]）的等度或缓梯度先把这两个化合物分开，但是这会严重影响分析速度，延长分析时间。在这篇文章中，我们使用了基于 Agilent 公司的 1260 或 1290 超高效液相色谱系统的自动方法开发系统及软件[3]对色谱柱和其他分析条件进行了自动筛选，并从中选出适合人参皂苷分析的色谱柱及相应分析条件，并在此基础上进行改进和优化，最终得到了两个基于不同选择性特性的高效快速的分析方法，可分别用于不同的分析目的。通过这个研究，我们找到了人参皂苷在不同色谱柱上的色谱行为差异；同时也为类似的方法开发工作推荐一个有用的工具。

仪器试剂及色谱条件仪器和试剂Agilent 1290 Infinity 自动方法开发系统，包括：1290 色谱泵、自动进样器、两个柱温箱（均配置 8 位 9 通阀）组成的柱温箱簇、二极 管 阵 列 检 测 器 ； ChemStation 色 谱 工 作 站 及 AgilentChemStation Method Scouting Wizard 软件。方法开发系统及方法筛选软件是仪器根据不同需求增加不同切换阀、柱温箱构成。利用方法筛选软件对多根色谱柱（最多 8 根）及多个色谱条件进行排列组合，在无人照管的情况下自动完成分析任务。方法筛选软件能根据谱图中色谱峰数量、分离度及保留时间等方法开发所关注的参数生成报告。Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统，配备脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器。Agilent 1220 Infinity 整体式液相色谱，配备脱气机，二元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器。色谱柱：Agilent Zorbax Bonus RP (3.0 x 50 mm，1.8 µm)，AgilentZorbax SB-C18（3.0 x 150 mm，1.8 µm）。以上设备，耗材及软件均由 Agilent Technologies, Inc.（美国）生产制造。实验所用的对照品均购买自中国食品药品检定研究院；乙腈为HPLC 级试剂 (Sigma-Aldrich)，实验用水由 Milli-Q 纯水机（Merck-Millipore，德国）制备；所有样品购自本地药店。

结果及讨论方法 1 的分析结果根据上述条件（方法 1）对含有三七成分的中药成分进行了分离，五种主要人参皂苷类成分分离良好，并且不受其他干扰组分的影响