三重四极杆液质联用测定人血清中的三种甲状腺激素

前言：许多临床研究实验室都非常关注甲状腺激素水平的测定。甲状腺素（3,5,3’,5’-四碘甲状腺原氨酸，又称 T4）是甲状腺激素活性更强形式的三碘甲状腺原氨酸（3,3’,5-三碘甲状腺原氨酸，又称 T3）的前体。反三碘甲状腺原氨酸（3,3’,5’-三碘甲状腺原氨酸，又称 rT3）则是甲状腺激素的非活性形式（图 1）。在血液中循环的大多数甲状腺激素都与转运蛋白相结合。只有非常少量的循环甲状腺激素是游离（非结合）状态的，具有生物活性。因此，测定极低浓度的这三种游离甲状腺激素对了解其在人体中的作用非常重要。本应用简报报导了将 1290 Infinity 液相色谱系统与配置 AJS 技术的 6490 三重四极杆液质联用系统联用，采用正离子电离模式建立了高灵敏度、准确测定血清中游离和总甲状腺激素的方法。该方法采用串联质谱 (MS/MS) 和多反应监测 (MRM)，在 0.5 到 1000 pg/mL 范围内线性良好，游离甲状腺激素的定量下限 (LLOQ) 范围为 1 到5 pg/mL，总甲状腺激素为 0.5 到2.5 pg/mL。

实验部分试剂和标样用 50:50 甲醇:30% 氢氧化铵配制 T4、T3、rT3及其13C标记的内标（购自IsoSciences）10 µg/mL 储备液。于 –20 °C 下保存。用甲醇稀释储备液来配制工作溶液。使用加入超低量激素和类固醇的血清（购自Golden West Biologics）与不同量的储备液配制浓度范围 0.5 到 1000 pg/mL 的校正标准液。5 ng/mL 标记的内标混合液用甲醇配制。标准参比物 (SRM 971) 购自美国国家标准与技术研究院 (NIST)。

仪器本方法采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统与 Agilent 6490 三重四极杆液质联用系统建立，后者配置 AJS，采用正离子模式。表 1 列出了仪器条件，6490 三重四极杆液质联用系统的采集参数见表 2。

样品前处理测定游离甲状腺激素所用的校正溶液和标准参比物样品通过 Amicon CentrifugeYM-30 过滤器制得。将 500 µL 血清放入Amicon Centrifuge YM-30 过滤器中，高转速下离心 2 小时。将 300 µL 滤液转移至干净的微量离心管中，加入 30 µL 内标，然后进行涡旋混合。加入 300 µL 乙腈，涡旋混合 1 分钟，然后高转速离心10 分钟。将上清液转移至 96 孔板中。对这些样品分别用醋酸乙酯进行液液萃取(LLE) 测定总甲状腺激素。取 200 µL 样品置于试管中，加入 20 µL 内标和 400 µL乙腈，然后进行涡旋混合。1.2 混合液中加入 1.2 mL 醋酸乙酯，涡旋混合 60 秒。以 13000 rpm 离心该试管 10 分钟，将有机相转移到干净试管中，然后进行蒸发。干燥后的样品用120 µL 75:25水:乙腈复溶。

结果与讨论方法性能由于 MRM transition 技术的普遍使用，T3 和 rT3 的色谱分离也就极为重要。图 2显示游离甲状腺素或总甲状腺素分析得到的三种形式甲状腺激素均实现了基线分离。校正曲线线性良好，在 0.5 到 1000 pg/mL范围内的变异系数 (R2) ≥ 0.990。与总甲状腺素相比，游离甲状腺素的 R2 值略高（图 3）。

方法灵敏度高，游离激素的 LLOQ 范围为 1 到 5 pg/mL，总甲状腺素为 0.5 到2.5 pg/mL（表 3）。游离和总甲状腺激素的色谱图表明，可以对极低浓度的分析物进行定量测定（图 4）。

结论建立了同时分析血清中甲状腺素 (T4)、3,3’,5-三碘甲状腺原氨酸 (T3) 和 3,3’,5’-三碘甲状腺原氨酸 (rT3) 的高灵敏度而特异的 LC/MS/MS 方法。测定低 pg/mL表 3. 人血清甲状腺激素的 LLOQ分析物游离 LLOQ(pg/mL)总 LLOQ(pg/mL)T4 5 1T3 1 0.5rT3 5 2.5水平的游离甲状腺激素需要进行简单的过滤前处理，而测定总甲状腺需要进行液液萃取。