推“柱”之荐|配方颗粒色谱柱推荐之鱼腥草
在前几期,我们为大家介绍并推荐了适用于中草药检测的各类安捷伦色谱柱,以便大家在日后的检测工作中匹配使用。本期继续带来适用于鱼腥草配方颗粒检测的色谱柱推荐,跟上我们,精彩继续!
Agilent TC 和 HC C18 系列是 2005 年推出通用 HPLC 色谱柱,采用高纯硅胶、专有的键合及封端技术,具有较高的碳载量、比表面积和惰性表面;TC(2) 和HC(2) 为该系列的第二代产品,在硅胶去活、封端工艺方面做了优化,更有利于碱性化合物的分离和峰形改善。TC/ HC 系列在中药分析中有大量应用,配方颗粒国家标准的应用统计点击这里。
根据国家药品监督管理局 《国家药品标准》中鱼腥草配方颗粒的检测项目,对其特征谱图和含量测定都采用 HPLC 方法。特征谱图及含量测定中要求理论板数按槲皮苷峰计算应不低于 3000。由于特征图谱的分析时间为 80 分钟,含量测定的时间也接近 20 分钟,耗时太长,仪器利用率很低,检测效率低下。本文先采用 Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱重现了国家标准方法,再使用 ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD, 2.1x100mm, 1.8μm 色谱柱,进行方法转换,在 1290 Infinity II 超高效液相色谱仪上实现了鱼腥草配方颗粒的特征谱图和含量测定 UHPLC 方法建立。
1 特征谱图
实验结果
图 1. 鱼腥草配方颗粒国标对照谱图与替代方法中供试品特征谱图(包括 HPLC 方法和 UHPLC 方法)的比较 (峰 1:新绿原酸;峰 2(S):绿原酸;峰 3:隐绿原酸;峰 5:金丝桃苷;峰 6:槲皮苷)
由于峰 4 没有对照品,本实验比较了该峰在方法转换前后的光谱图,其光谱一致,见图 2 所示。
图 2. 方法转换前后峰 4 的光谱对比
色谱条件:
标准方法:
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流动相:A:乙腈;B:H2O(0.1%磷酸)
✓
梯度:0-10 min,94 %-92%B;10-25 min,92%B-85%B;25-30min,85-84%B;30-45min,84-82%B;45-55min,82-73%B;55-75min,73-73%B;75-80min,73-94%B;后运行,7min
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流速:1mL/min
✓
柱温:30 °C
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检测波长:0~30分钟为326nm,30~80分钟为254nm(采样频率:2.5Hz)
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进样量:10 μL
转换后的UHPLC方法:
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梯度:0-1.5 min,94 %-92%B;1.5-3.8 min,92%B-85%B;3.8-4.5min,85-84%B;4.5-6.8min,84-82%B;6.8-8.3min,82-73%B;8.3-12min,73-73%B;12-12.5min,73-94%B;后运行,3min
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流速:0.6ml/min
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柱温:30 °C
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检测波长:0~4.5分钟为326nm,4.5~12.5分钟为254nm(采样频率:20Hz)
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进样量:1 μL
系统适用性结果见下表:
结果
1)使用 Agilent TC-C18 色谱柱,峰 1,3,4 的相对保留时间(RRT)和峰 5、6 的相对峰面积满足标准要求,能重现国标方法中的特征图谱。
2)使用 ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 UHPLC 色谱柱,峰 4 的 RRT 超过标准要求的 10%, 但通过光谱显示,UHPLC 方法中峰 4 的光谱与 HPLC 方法中保持一致,综合研判,应为同一物质。
3) 转换成 UHPLC 方法后,分析时间缩短至 HPLC 方法的 16%。
2 含量测定
实验结果
图 3. 鱼腥草配方颗粒供试品含量测定标准方法和 UHPLC 方法谱图对照
色谱条件:
标准方法:
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流动相:A:乙腈;B:H2O(0.1%磷酸)
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比例:A:B=23:77
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流速:1mL/min(HPLC),0.6 mL/min(UHPLC)
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柱温:30 °C
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检测波长:254nm(4nm);采样频率:2.5Hz(HPLC), 20Hz (UHPLC)
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进样量:10 μL(HPLC), 1 μL(UHPLC)
系统适用性及检测结果见下表:
结果
1)使用 TC-C18 柱测定供试品中槲皮苷的含量,其理论板数符合标准规定。
2)通过 UHPLC 方法转换,系统适应性结果满足要求,检测效率提高 5 倍。
实验结论
本实验选用 TC-C18 HPLC 色谱柱,重现了鱼腥草配方颗粒特征谱图及含量测定方法,均符合标准要求。通过 UHPLC 方法转换后,使用 ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD 色谱柱,系统适应性试验、含量检测结果与 HPLC 结果一致,检测效率大大提高。
仪器系统及色谱柱推荐
1260 Infinity II 四元 HPLC 系统:四元泵(G7111B),自动进样器(G7129A),柱温箱(G7116A),VWD(G7114A)
1290 Infinity II 四元 UHPLC 系统:全能泵(G7104A),自动进样器(G7129B),柱温箱(G7116B),DAD(G7117A)
其它详细操作可以参考 Agilent 配方颗粒图谱集,或联系 Agilent。
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