干货分享：药典中为什么选择HPLC-柱后衍生法测试氨基酸？

2020年版中国药典收载了5种复方氨基酸注射液、9种多肽类药物及1种中药品种，均需要采用氨基酸分析方法测定药品中氨基酸含量或氨基酸组成。为了指导药典标准执行过程中如何选择适宜的方法，国家药典委员会委托中检院牵头承担完成了“药品中氨基酸分析法的建立课题”，拟定了中国药典氨基酸分析指导原则，补充之前药典中关于选择测试方法的空白。

                    图1：各国药典介绍的氨基酸分析方法

问题来了

这么多的检测方法应该如何选择？

蛋白质和多肽的氨基酸分析，需要将样品先水解成游离的氨基酸才能进行分析。由于氨基酸本身并没有发色集团或荧光基团，所以游离氨基酸通常需要衍生化才能测定。药品中氨基酸测定常用方法一共有6种，分别是：

① 柱前PITC衍生氨基酸测定法；

② 柱前AQC衍生氨基酸测定法；

③ 柱前OPA和FMOC衍生氨基酸测定法；

④ 柱前DNFB衍生氨基酸测定法；

⑤ 柱后茚三酮衍生氨基酸锂离子交换系统测定法；

⑥ 柱后茚三酮衍生氨基酸钠离子交换系统测定法。

按照衍生顺序可分为柱前衍生和柱后衍生

柱前衍生法

原理：根据氨基酸与衍生试剂反应，生成有紫外吸收的衍生物，后经反相液相色谱分离后用紫外检测器在一定波长处检测，在一定的浓度范围内其响应值与氨基酸浓度成正比；

优点：对仪器配置要求不高，实验成本低。

缺点：某些衍生物不稳定，无法定量，分离效果一般。

柱后衍生法

原理：通过调节系统pH值及离子强度，采用锂/钠离子交换系统，实现离子交换色谱柱对混合氨基酸的分离，经离子交换色谱分离的氨基酸与茚三酮反应，一级氨基酸生成紫色化合物，在570nm波长处有最大吸收。二级氨基酸（如脯氨酸）生成黄色化合物，在440nm波长处有最大吸收。在440nm和570nm波长处分别检测，在一定的浓度范围（20～500pmol）内，氨基酸衍生化产物的吸光度与氨基酸浓度成正比；

优点：自动化程度高，不易受基质干扰。

缺点：针对《氨基酸分析指导原则草案公示稿（第二次）》提到的采用柱后茚三酮衍生氨基酸锂离子交换法，分析时间长，异亮氨酸和亮氨酸间的分离难以达到要求。改善建议采用温度梯度可以改善分离效果。

Pickering |氨基酸分析解决方案

1、Pickering参照欧洲药典8.0，提供了完整的氨基酸分析解决方案——

方案包括Onyx-PCX 柱后衍生仪、色谱柱和保护柱、缓冲液和茚三酮衍生试剂。

Pickering Onyx-PCX可以修改运行条件，执行温度梯度程序，缩短运行时间加速氨基酸分离,符合欧洲药典8.0的系统适用性要求,（亮氨酸和异亮氨酸分离度要大于1.5）。

                           表1：欧洲药典8.0参考指南

2、分析条件：

色谱柱：高效钠离子交换柱 4.6*110mm，货号1154110T；

流速:0.6mL/min；

流动相:见表2；

进样体积:50ul；

  表2：HPLC梯度程序（115411T）

3、柱后衍生条件：

柱后衍生系统:Onyx PCX；

反应器体积:0.5mL；

试剂:Trione®茚三酮 ；

反应温度:130ºC；

柱温:见表3；

流速:0.3 mL/min；

检测波长:UV/Vis 570nm一级氨基酸；440nm二级氨基酸。

   表3：柱温程序

图1：欧洲药典8.0方法分析氨基酸的钠柱色谱图一 _(浓度3 ug/mL, 进样体积50 uL)

图2：氨基酸分析钠柱色谱图，以欧洲药典8.0方法计算系统适应性检查 _(参考表1).

Proline – 1.2 ug/mL; Isoleucine – 3 ug/mL; Leucine – 3 ug/mL; Ammonia – 0.12 ug/mL. 进样体积50 uL.

4、结论：

今年3月份发布的针对《氨基酸分析指导原则草案公示稿（第二次）》中，以欧洲药典为参照,弥补了我国2020版药典之前对氨基酸分析指导意见的空白，详细的阐述了几个常用方法的原理以及特点。Pickering参照欧洲药典8.0，提供完整解决方案，HPLC+Onyx PCR 即可实现药典中提到的柱后茚三酮衍生氨基酸锂离子交换系统测定法和柱后茚三酮衍生氨基酸钠离子交换系统测定法，实现方法扩增。

引用：氨基酸分析指导原则草案公示稿（第二次）

关于Pickering Laboratories

美国Pickering Laboratories公司是仅有的专业提供人工测试体液和柱后衍生化学试剂、色谱柱、分析方法等柱后衍生分析整体解决方案的机构，其不断创新及良好的信誉被众多的美国政府机构如EPA、ATF、FDA、AOAC和著名的厂商所认可。