用于营养标签的食品基质中脂溶性维生素的分析

引言维生素是维持机体健康生长且必须从食物中获取的微量营养物质。维生素一般被分为两类，水溶性维生素和脂溶性维生素。由于食品中存在从纳克到微克级不同含量水平的维生素，因而像婴幼儿配方奶粉中的维生素，需要标示其含量是美国食品药品监督管理局（FDA）的一项强制性规定。各维生素化学性质的差异使得所有维生素的共同提取和分析挑战。基于此，水溶性和脂溶性维生素的分析通常分别进行。之前的一篇安捷伦应用解决方案1提供了同时分析 10 种水溶性维生素的方法。本研究探讨了同时分析 9 种脂溶性维生素的方法，这些都是食品中常见的脂溶性维生素。尽管各种脂溶性维生素的提取步骤不尽相同，但文中建立的分析方法可通过一次 LC 运行对分析物定量，从而降低了分析难度。本文采用 UV 检 测，建 立了 耗 时 大 约15 min、灵敏度高、耐用性好的方法，可同时分析 9 种脂溶性维生素，并可将该 HPLC 法转换为耗时仅 3.5 min 的UHPLC 法，满足了特别需要短分析时间的用户。

实验部分仪器和软件采用包含以下模块的 Agilent 1260 Infi nity四元泵 LC 系统：• 集成真空脱气机的 Agilent 1260 Infi nity四元泵（G1311B）• Agilent 1260 Infi nity 高效自动进样器（G1367E）• Agilent 1260 Infi nity 柱温箱（G1316C）• 配备 60 mm 光程流通池的 Agilent 1260Infi nity 二极管阵列检测器（G4212B）采用包含以下模块的 Agilent 1290 Infi nityLC 系统建立并实现 UHPLC 分析：• 集成真空脱气机的 Agilent 1290 Infi nity二元泵（G4220 A）及 100 µL Jet Weaver混合器• Agilent 1290 Infi nity 高效自动进样器（G4226A）• Agilent 1290 Infi nity 柱温箱（G1316C）• 配备 10 mm 光程流通池的 Agilent 1290Infi nity 二极管阵列检测器（G4212A）

色谱柱：• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱，内径 2.1 mm，柱长 75 mm，填料粒径 2.7 µm（697775-902）• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱，内径 3.0 mm，柱长 150 mm，填料粒径 2.7 µm（693975-302）软件：• 安捷伦化学工作站（B.04.02 版）试剂和材料所有化学药品和溶剂均为色谱级。高纯水由 Milli Q 水纯化系统（Millipore Elix10，Millipore，USA）制备。超梯度级的乙腈和甲醇购自 Lab-Scan 公司（泰国曼谷），Biotech 级的四氢呋喃（THF）购自 Sigma 公司（德国）。洗脱液添加剂醋酸购自 Fluka 公司（德国），本研究所用的其它化学品均为 Aldrich 公司（印度）产品。标准品：甲萘醌（K3）、亚麻酸（6-ω 脂肪酸）、视黄醇、视黄酸、胆骨化醇（D3）、生育酚用于本研究中回收率测定和营养标示分析的婴幼儿配方奶粉和复合维生素片均购自当地。

往 5 g 婴幼儿配方奶粉或单片复合维生素片中加入 25 ng 标准品，通过加标和不加标样品分析进行回收率研究。该方法可有效转移至 UHPLC。本文中评价了各种维生素的 LOD、LOQ 和线性关系，并通过峰面积和保留时间的 RSD 评价方法的精密度，同时绘制了所有维生素的线性曲线。

结果与讨论分离与检测采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm x 150 mm，2.7 µm）色谱柱使9 种脂溶性维生素 13 min 内得到分离。基于分子结构的差异，不同维生素的最大吸收波长不同。9 种维生素的色谱洗脱模式见图 1，各维生素及其最大吸收波长如表 2 所示。216 nm 所检测色谱图中的基线漂移是因为在梯度运行中流动相改性剂的比例发生了变化。采用化学工作站软件中的峰纯度检测功能考察每个色谱峰的纯度，然后评价方法的专属性。本文中方法学验证内容包括了精密度、线性范围、准确度、专属性、回收率和耐用性实验

保留时间（RT）和峰面积的精密度计算进样量为 50 ng 的 9 种维生素的保留时间（RT）和峰面积的相对标准偏差（RSD）以评价方法的精密度。测得峰面积的 RSD 最大值为 0.035%，保留时间的RSD 最大值为 0.04%。9 种维生素的峰面积和保留时间的 RSD 值如图 4 所示。

耐用性通过刻意改变六个关键的方法参数评价该方法的耐用性，同时计算所产生的峰面积和保留时间的偏差，并与原方法结果进行比较。例如，维生素的加标混合样品平行测定 6 次，保留时间和峰面积的允许偏差分别为 ± 3% 和 ± 5%。耐用性研究结果汇总见表 4。耐用性研究考察了增大流速、改变流动相组成及柱温，结果表明保留时间的偏差均在允许的限度内。但是，洗脱梯度斜率变化的影响较大，测得的保留时间偏差超过了限度。除了8 种维生素峰面积的偏差在大多数实验中均在允许的限度内。峰面积受流速、梯度斜率、柱温、流动相组成和检测波长的影响很大。并且检测波长需严格控制。耐用性结果表明，该方法对于常规检测是可靠的，在很大程度上，测定结果未受参数改变的影响。

……

结论本研究使用 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱对 9 种脂溶性维生素进行分离和定量。先用 Agilent 1260 Infi nity LC 系统建立了耐用、耗时 15 min 的 HPLC 梯度洗脱方法。该方法可成功地用于定量分析维生素，如甲萘醌、亚麻酸以及不同形式。本方法的线性范围宽，涵盖许多食品中这些维生素可能的浓度。梯度洗脱可确保更好的色谱分离、提高灵敏度并减少基质干扰。该方法简便、快速、专属性强、灵敏度高，并具有良好的精密度、线性关系和回收率。通过婴幼儿配方奶粉和复合维生素片中的定量分析证实了该方法的高效性。之后，将该方法转换为采用 Agilent 1290Infi nity LC 系统的 UHPLC 法，其耗时仅3 min，并可节省 66% 的分析时间和溶剂。采用 Agilent 1260 Infi nity LC 系统和 Agilent 1290 Infi nity LC 系统的方法可用于脂溶性维生素准确的常规营养标示分析。