橙汁中抗坏血酸、柠檬 酸和苯甲酸的分析

摘要：食品添加剂，如抗氧化剂和防腐剂的添加，可以延长食品的保质期。在本文中，我们描述了一种定量分析橙汁中抗氧化剂和防腐剂（柠檬酸、苯甲酸）的方法。该方法的开发是通过采用配备 Agilent Poroshell EC-C18 色谱柱的 Agilent 1260 Infi nity LC 系统来实现的。对样品分析进行部分方法学验证，证明其线性、稳定性，以及峰面积和保留时间的精密度符合要求。该方法中苯甲酸的检测限为 0.2 µg/mL。在样品回收率的研究中，所有化合物的回收率都大于 90%。该方法通过采用 Agilent 1290 Infi nity LC 系统可有效地转换成一个快速的超高效液相色谱（UHPLC）方法。新方法分析速度比原方法快5 倍，并且苯甲酸的检测限不变。两种方法都能被食品制造商有效采用，实现对食品添加剂的质量控制。

引言抗氧化剂，如抗坏血酸的抗氧化作用是通过减少环境中的氧来实现的。抗坏血酸优先被氧化并生成去氢抗坏血酸（DHA），从而防止了基质的氧化。防腐剂，如柠檬酸或苯甲酸防止或抑制食品中微生物的生长。在一些水果中天然含有抗坏血酸、柠檬酸和苯甲酸[1]，额外添加这些成分可延长果汁的保质期。虽然果汁中苯甲酸的含量法规限值为 400 µg/mL 到 600 µg/mL，但我们更加关注的是由苯甲酸和抗坏血酸在一定条件下反应生成的致癌物质苯[2,3]。据报道，抗坏血酸的含量随时间、温度和其他因素变化而减少并最终生成 DHA。AOAC 方法 967.22 中检测分析含量的方法是首先氧化抗坏血酸生成 DHA，然后再进行衍生和荧光检测。对于 UV 分析，DHA 在波长 220 nm 以上紫外吸收很小，而抗坏血酸在 244–265 nm 波长处有紫外吸收（取决于缓冲液的 pH值[5]）。AOAC 方法 994.11 采用 UV 检测分析橙汁中的苯甲酸。本文运用简单的样品提取步骤并采用 UV 检测器对抗坏血酸、柠檬酸和苯甲酸进行定量分析。

试剂和化学品所有试剂和溶剂均为 HPLC 级。高纯水由 Milli Q 水净化系统制备（Millipore Elix 10，美国）。梯度使用的乙腈购自 Lab-Scan 公司（泰国），磷酸二氢钾购自 Fluka公司（德国）。磷酸购自 Fluka 公司（瑞士）。抗坏血酸、柠檬酸和苯甲酸标准品均购自 Sigma-Aldrich 公司（印度）。购买在印度生产的国际品牌橙汁。

实验部分仪器及软件Agilent 1260 Infi nity 二元液相色谱系统由以下几个模块组成：• Agilent 1260 Infi nity 二元泵（G1312B）• Agilent 1260 Infi nity 自动进样器和恒温器（G1367E, G1330B）• Agilent 1260 Infi nity 柱温箱（G1316A）• Agilent 1260 Infi nity 二极管阵列检测器 （G4212B）配备 10 mm 最大光强流通池采用 Agilent 1290 Infi nity LC 系统实现了UHPLC 分析的开发和运行。该系统由以下几个模块组成：• Agilent 1290 Infi nity 二元泵（G4220A）• Agilent 1290 Infi nity 自动进样器和恒温器（G4226A, G1330B）• Agilent 1290 Infi nity 柱温箱（G1316C）• Agilent 1290 Infi nity 二极管阵列检测器（G4212A）配备 10 mm 最大光强流通池色谱柱：• Agilent Poroshell 120 EC-C18,4.6×100 mm，2.7 µm （部件号697975-302）工作站软件：• B.04.02 版 Agilent ChemStation 工作站

色谱参数反相液相色谱法和 UHPLC 法的色谱参数见表 1。标准品制备准确称取抗坏血酸、柠檬酸和苯甲酸，用流动相 A 分别配制浓度为 5000 µg/mL（ppm）、50000 ppm 和 100 ppm 标准储备液。超声 10 min 使苯甲酸溶解*。用流动相 A 依次稀释上述三种标准储备液配制成线性浓度水平的标准溶液，见表 2。pH 值 2.5 的流动相A能防止抗坏血酸的电离。样品制备将适量的磷酸滴加到 5 mL 橙汁中，调节其 pH 值到 2.5 并涡旋混合。样品溶液在1897×g 离心力下离心 5 min，通过 0.2 µm安 捷 伦 再 生 纤 维 素 滤 膜 过 滤（部 件 号5185-5830）。过滤后的样品溶液直接用于样品分析。步骤5 µL 流动相 A 作为空白进样分析，每个线性浓度水平重复分析六次。每个浓度水平的峰面积和保留时间的数据被用于计算相对标准偏差（RSD）。根据苯甲酸低线性浓度进样计算其检测限（LOD）和定量限（LOQ）。确定线性浓度之前，进样分析萃取后的橙汁样品以测定其中抗坏血酸、柠檬酸和苯甲酸的大致浓度。以每个线性浓度水平的平均峰面积对溶液浓度作图得线性曲线

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进行回收率实验时，将橙汁的 pH 值调节到 2.5。添加高浓度和低浓度的柠檬酸和苯甲酸到橙汁中，配制成高浓度和低浓度的加标样品。高浓度和低浓度加标样品的差异用于回收率计算。为评价该方法的耐用性，改变了四个关键的方法参数——流速 ± 2%、TCC 温度± 5%、进样量 ± 5% 和波长 ± 3%。针对每一个变动，重复进样分析浓度分别为 108 ppm、7000 ppm 和 5 ppm 的柠檬酸和苯甲酸混合加标样品七次。分析了三种不同品牌橙汁中该三种酸性物质的含量。随后将该方法成功转换成一个 UHPLC 方法。评估每个标准品的 LOD、LOQ 和线性，同时用峰面积和保留时间的 RSD 验证该方法的精密度。

结果与讨论分离与检测采用多种色谱柱分离检测柠檬酸和苯甲酸。标准品用流动相 A 溶解，同时添加标准品到橙汁中，配制成加标样品用以测试基质干扰。安捷伦苯基-己基柱和 Poroshell EC-C18 色谱柱对水溶性标准品具有良好的分离性能。Agilent Poroshell EC-C18 色谱柱被用于进一步实验。在一个低的 TCC 温度和60% 甲醇 – 40% 乙腈的流动相 B 下，标准品峰与基质峰实现了良好的分离。pH 值 2.5 时，游离型抗坏血酸在波长243.5 nm 处具有最大的紫外吸收。在这个波长下基质吸收较少，所以能简单地定量分析抗坏血酸。在波长 210.0 nm 处检测柠檬酸，而在波长 230.0 nm 处检测苯甲酸。因为抗坏血酸在低温下稳定，所以在整个分析过程中，自动进样器温度一直恒定在 4 °C。Margolis 等人[6] 报道指出当抗坏血酸储存在自动进样器样品瓶中 22h 后，其浓度会显著下降。结果显示，在不同批次的自动进样器样品瓶中抗坏血酸的浓度损失可高达 89%。然而，Margolis 的研究表明样品瓶在经过酸碱清洗后，抗坏血酸的最大损失只有 4%。

在本研究中，测试了三种不同的样品瓶：• MS 校验样品瓶 （p/n 5190-2280）• ALS 样品瓶 （p/n 5182-0716）• 经酸碱清洗的 ALS 样品瓶校准标准品储存于缓冲溶液中，并放置于4 °C 的 ALS 恒温箱中，16h 后在所有三种样品瓶的样品中，抗坏血酸的峰面积损失为 3%，而柠檬酸和苯甲酸的峰面积损失均小于 1%。本研究表明这三种样品瓶都可以用于本分析。在本应用报告中，使用的是 MS 校验样品瓶。图1展示了采用Agilent 1260 Infi nity LC 系统分离抗坏血酸、柠檬酸和苯甲酸的色谱图。一步升至25% 流动相 B 的梯度程序对于从基质中洗脱出苯甲酸峰非常必要。维持高比例的有机相 13 min 以上，可确保*去除来自橙汁的基质峰。