用 Agilent 1200 系列蒸发光散射检测器分析传统中药

摘要中药里经常有一些成分必须用 HPLC液相色谱仪 检测，但缺乏生色团，在紫外检测下没有信号。Agilent 1200 系列蒸发光散射检测器（ELSD）可以检测比流动相挥发性低的所有溶质，因此是一种替代手段。在中国药典 2005 版中，有几种需要使用 ELSD 检测的中药成分，本应用报告列举了两个例子——银杏（Ginkgo biloba L）中的黄酮，以及黄芪中的黄芪甲苷。

前言蒸发光散射检测器作为 HPLC 系统中对无 UV 吸收分析物的准通用型检测器，正得到越来越广泛的应用。特别是在草药中，越来越多无 UV 吸收的化合物需要以非衍生化状态进行检测。Agilent 1200 系列 HPLC 产品线中的一个新成员——蒸发光散射检测器——将为这类应用提供帮助。Agilent 1200 系列 ELSD 可以检测比流动相挥发性低的所有溶质。只有样品形成的非挥发性颗粒才能产生信号。如果某些化合物没有生色团，其挥发性又比液相色谱溶剂低，ELSD 就可作为使用简便、灵敏度高的优良检测器。梯度流动相也不干扰检测。如果流动相在特定 UV波长下产生强吸收，则 ELSD 将是另一种替代手段，可以保持基线的稳定，并产生强信号。ELSD 的工作原理包括三个主要的连续步骤：a) 用氮气或空气使色谱洗脱液雾化b) 在相对低的温度下让流动相蒸发c) 残留颗粒（包括分析物分子）产生光散射图 1 显示了检测的各个阶段。

中药的某些组分没有生色团，因此需要一种通用的检测器进行检测。Agilent1200 系列 ELSD 与其它通用检测器相比有明显优势。质谱（MS）较昂贵，而且需要经过良好培训、具备相关知识的操作者。质量控制部门的常规分析工作一般不用质谱。示差折光检测器能进行通用的检测，但只能用于等度分析，不适合分离复杂混合物。如果配置 UV 检测器的系统串联一台 ELSD，将能同时检测各类结构的多种化合物（带生色团或不带生色团）

中国药典 2005 版中，有几种中药成分需要用 ELSD 检测。例如，银杏中的黄酮和黄芪中的黄芪甲苷。银杏（Ginkgo biloba L.）及其提取物不仅在中国非常有名，而且也在世界各地被广泛用于治疗心脑血管疾病。它的疗效主要来源于与黄酮一起存在的银杏内酯和白果内酯。质量控制方法必须能够测定银杏及其制品中黄酮的含量。黄芪（Radix Astragali），是一种在中国广泛使用的中药。药理实验和临床研究已证明，黄芪具有多种生物活性，被用于治疗肾炎、糖尿病、高血压等疾病。其有效成分之一，黄芪甲苷，不含生色团，需要一种通用检测器来测定其含量。本应用报告中，我们探讨了银杏黄酮和黄芪甲苷的分离和定量分析。本报告还提供了使用 Agilent 1200 系列 ELSD 的一些建议。

实验部分仪器开发高分离度快速液相色谱（RRLC）方法，使用配置如下的 Agilent 1200 系列RRLC 系统：• 带脱气机的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵• Agilent 1200 系 列 SL 型 高 效 自 动 进样器• Agilent 1200 系列 SL 型柱温箱• Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器，配置微量流通池 (2 µL 体积，3 mm光程)• Agilent 1200 系列蒸发光散射检测器，带标准喷雾器• Agilent 化学工作站 B.03.02，用于数据采集和处理• Agilent ZORBAX XDB-C18 快速分离高通量 (RRHT) 色谱柱，3.0 x 50 mm，1.8 µm 粒径

系统设置HPLC 组件按一般方式连接，如图 2 所示。Agilent 1200 系列 ELSD 通过 RS-232 电缆与计算机相连。遥控电缆将 Agilent1200 系列 ELSD 与 HPLC 其它组件连接。系统测试实验开始之前，应对 Agilent 1200 系列ELSD 进行测试，以确保其处于良好状态，且性能合格。测试条件：• 样品： 250 µg/mL（或相似浓度）• 溶剂： 等度，80% 水，20% 乙腈• 流速： 1 mL/min• 进样量： 20 µL• 色谱柱： Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18，4.6 x 150 mm，5 µm (或其它相当规格的色谱柱)• 柱温箱 (TCC) 温度：40 °C• ELSD 温度：40 °C• ELSD 压力：3.5 bar (51 psi)• ELSD 增益：7• ELSD 过滤器：1 秒• 一般系统：Agilent 1200 系列标准液相色 谱 系 统 （请 注 意 ，需 要 进 行 常 规HPLC 分 析 时 ，也 可 以 使 用 Agilent1200 系列 RRLC 系统)方法运行后，若仪器安装后处于良好状态，应记录检测器响应值。以后每次需要的时候都应该用同样的方法进行性能检查。ELSD 不能使用不挥发的缓冲液。如果不挥发的盐进入 ELSD，检测器将无法区分这些不挥发颗粒是来自样品还是缓冲液。因而使基线明显抬高，样品的信噪比降低。由于 ELSD 只能检测挥发性比流动相差的化合物，所以在开发新方法时，应当用另一种检测器来确定所有化合物都可以从色谱柱中洗脱

标准品和样品制备本实验使用下列标准品、样品和溶剂：• 标准品购自 NICBP（中国药品与生物制品检定所）• 溶剂（甲醇、乙腈、四氢呋喃）均购自Thermo Fisher Scientific 公司• 水经 Millipore 纯水系统制备• 黄芪样品购自中药店• 银杏提取物由用户馈赠样品制备过程如下，称取 1 克样品，溶于5 mL 甲醇，超声混合 30 分钟，过滤，取澄明溶液进样。银杏分析方法• 流动相： A = 水，B = 四氢呋喃/甲醇，体积比 10/25• 流速： 0.7 mL/min• 梯度： 0 分钟，12% B；10 分钟，16% B；15 分钟，22% B；20 分钟，30% B• ELSD： 温度 = 40 °C，压力 = 50 psi，增益 = 7，过滤器 = 3 秒黄芪分析方法• 流动相： A = 水，B = 乙腈• 流速： 0.7 mL/min• 梯度： 0 分钟，20% B；1 分钟，30% B；5 分钟，35% B；30 分钟，100% B• ELSD： 温度 = 40 °C,压力 = 50 psi，增益 = 5，过滤器 = 3 秒

结果与讨论银杏的分析银杏及其制品的成分非常复杂，需要用HPLC 进行良好分离。过去由于仪器的限制，常常采用等度方法。等度方法的缺点是分析时间长，分离度较差。本应用报告采用梯度方法，在较短的时间内获得较好分离。图 3 显示的是银杏黄酮标准品的色谱图，ELSD 和 UV 两个通道信号的对比。黄酮在 210 nm 波长下有很低的响应，254 nm没有响应。对 UV 和 ELSD 的灵敏度进行比较说明了测定银杏中黄酮时采用 ELSD是必要的。本方法还能通过查看 UV 补充信号辨别这些色谱峰中是否包含纯的黄酮。图 4 中的色谱图显示 ELSD 能够检测出银杏样品中的许多峰。该样品成分非常复杂，ELSD 信息有助于找出更多组分，包括缺乏生色团的成分。4 个黄酮峰彼此分离，并与其它组分分开。运行 ELSD 方法时，即使 ELSD 信号中已经没有色谱峰出现，还是要监测 UV 通道，以确定所有组分都已从系统中洗脱出来，避免污染色谱柱和系统。