采用LC/MS鉴别人参制品及人参植物的种属差异

 摘要有历史记载以前，人们就已经开始用草药提取物治疗疾病。同种植物常常因地域、气候、生长条件或亚种不同，具有不同形式的活性成分。中药（TCM）中使用的一些植物就是例子。人参作为其中的代表，其亚种广泛分布在整个亚洲和美洲大陆。本应用报告报导了用 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统，配置快速分离高通量（RRHT）柱，对复杂人参提取物中的组分进行分离的方法。用 LC/ESI 八极加速飞行时间（oaTOF）和 LC/离子阱质谱检测并鉴别了地域或生物源性不同的人参所含化合物的差别。基于已知的组分结构信息，通过测定组分谱图可为人参制品的鉴定提供证据。

前言不同地域和文化的传统天然疗法，经常使用同样的植物制成草药提取物和酊剂治疗疾病。所用植物生长在不同条件下，表现为不同的亚种，其活性组分便有不同 。这 种 现 象 的 典 型 例 子 就 是 人 参(Panax spec.)，在中药(TCM)中已经使用了几千年。在整个亚洲和美洲大陆，这种草药有多种亚种分布[1]。人参这类复杂天然提取物的分析方法，是高效液相色谱(HPLC)[2]。其主要活性化合物为三萜皂甙，称为人参皂甙，已分离并鉴定出了 80 多种。目前采用 LC/ESIoaTOF 精确质量测定和 LC/离子阱或LC/三重四极杆仪，通过 MS/MS 和 MSn进行结构解析，鉴别人参皂甙复杂而相似的结构[3]，可以区分人参的不同产地或亚种，并通过药物活性成分串联质谱分析所得到的碎片验证药用人参的质量[4]。本应用报告报导了用 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统，配置快速分离高通量(RRHT)柱，分离人参(Panaxginseng)和西洋参(Panax quinquefolius)复 杂 提 取 物 成 分 的 方 法 。 用 LC/ESI oaTOF 精确质量测定和 LC/离子阱MSn 质谱进行检测和鉴定，区分地域或生物源性的差异。根据已知的组分结构信息，测定组分轮廓图可以为人参制品鉴定提供证据。用 ESI oaTOF 进行精确质量测量解析人参皂甙结构，包括 CID 裂解和离子阱 MSn 分析已在本研究的第 I 和第 II 部分中详细介绍[5,6]。

实验部分仪器• 带脱气机的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。该泵能够用 1.8 µm 粒径 RRHT 柱进行高分离 HPLC 分析，以获得最佳分离性能• 带温度控制的 Agilent 1200 系列 SL 型高效自动进样器(h-ALS SL)。该自动进样器为配合 1200 系列 SL 型二元泵使用而特别设计，具有延迟体积• Agilent 1200 系列柱温箱 (TCC)。该 TCC与 SL 型二元泵一起使用，在优化的延迟体积条件下可选择分离式热交换器和柱后冷却，并可选择 2 位/10 通阀进行交替柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器 (DAD)。该 DAD 能以高达 80 Hz 的采样速率采集数据，并具有内置数据存储功能• Agilent 6210 MSD TOF。八极加速飞行时间质谱仪，带双喷雾器接口以进行质量校正，能以最高的准确性获取分子质量数。该飞行时间质谱仪能以 40 Hz 速率采集数据，还能进行正/负切换• Agilent 6330 离子阱，用于 MSn 串联质谱实验的离子阱质谱仪，扫描速度高达每秒 26000 m/z，具有自动数据自适应MSn 功能• LC/离子阱仪器控制软件为化学工作站B01.03，离子阱软件 5.3，用离子阱数据分析软件 3.3 进行数据分析• LC/TOF 仪器控制采用 Mass Hunter 工作站进行数据采集，AnalystQS 进行数据分析• 色谱柱：ZORBAX SB-C18，2.1 x150 mm，1.8 µm

样品1. 粉碎的冻干人参 (1 g) (Panax ginseng)和 粉 碎 的 冻 干 西 洋 参 (1 g) (Panaxquinquefolius) 分别加入 10 mL 甲醇，超声处理 30 分钟，过滤后直接分析2. 糖浆——如韩国人参提取物药用制品(ILHWA Co., LTD, Korea) (1 g)溶解于100 mL 水/甲醇 (1/1，v/v)中，过滤后直接分析系统设置LC/MS 系统的设置如图 1 所示。Agilent1200 系列 SL 型二元泵通过一根 0.17 mm内径不锈钢毛细管与 Agilent 1200 系列h-ALS SL 连接。为减少延迟体积，h-ALSSL 的针座毛细管采用 0.12 mm 内径，用同样规格的毛细管在柱温箱中连接低延5989-5493EN 100迟体积(1.6µL)热交换器，柱温箱链接色谱柱。将 2 µL 流通池置于 SL 型 DAD 中用于 UV 检测。出口毛细管直接连在 ESIoaTOF 或离子阱质谱仪的电喷雾源喷雾器上。从人参（Panax ginseng）复杂天然产物提取物的 UV 分析可以看出，对仪器设置进行了优化以获得最高分离度[5]。使用 2.1 x 150 mm，1.8 µm 色谱柱，系统反压一般在 560 bar 左右。UV 色谱图中基线分离的色谱峰最大峰宽（FWHM）小于0.1 分钟。高分离配置的 Agilent 1200 系列二元泵系统的全部性能在另一篇应用报告中介绍[7]。只要稍加改动，这一系统也可以用于高通量分析[8]。

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方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作条件如下：溶剂 A： 水 + 0.1% TFA溶剂 B： 乙腈+ 0.1% TFA流速： 0.5 mL/min梯度： 0 分钟 5% B1 分钟 5 % B60 分钟 85 % B61 分钟 95 % B70 分钟 95 % B停止时间： 70 分钟后运行时间： 15 分钟• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自动进样器进样 10 µL 样品，并将样品冷却到10 ºC。1 分钟后将样品定量环切换到旁路，以降低延迟体积• Agilent 1200 系列柱温箱，配备 1.6 µL低延迟体积热交换器，设置为 50 ºC• Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器，用 80 Hz 采集数据，检测波长设置为 220 nm/4 nm，参比 360/100，采用2 µL 流通池，30 mm 光程• TOF 质谱仪操作条件如下：离子源： ESI , 正离子模式，带双喷雾器，参考质量干燥气体： 12 L/min干燥温度： 200 ºC雾化器： 35 psi扫描： 200-1300碎裂电压： 150 V 或 CID 300 V锥孔电压： 60 V毛细管电压： 3000 V• 离子阱质谱仪的操作条件如下：离子源： ESI 正离子模式干燥气体： 5.0 L/min干燥温度： 300 ºC雾化器： 15 psi靶标： 150000最大累加时间：100 ms扫描： 200-1300平均： 2MSn： 自动化MS/MS和MS3

结果与讨论采用高分离度 HPLC 1.8 µm 粒径色谱柱分 离 了 人 参 (Panax ginseng)和 西 洋 参(Panax quinquefolius)样品中的各化合物，揭示了不同人参亚种粗提物中各成分的差异。很明显，差异不仅在于人参皂甙的浓度不同，还在于各种属中存在不同的化图 1Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统与 MS 联用，采用低延迟体积配置101 5989-5493EN合物。实验证明，在离子阱 MS 基峰色谱图（图 2 和图 3）中，20 到 40 分钟之间洗 脱 的 主 要 组 分 为 常 见 的 人 参 皂 甙Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rc 和 Rd，以及特殊的人参皂甙 Rf 和 F11。1.8 µm 粒径色谱柱除了具有良好的分离度以外，其分离度还可以随温度改善。例如，在 50 °C 柱温下，所有人参样品中都含有的人参皂甙 Rem/z 946.5 [M+H]+ 和人参皂甙 Rg1 m/z823.5 [M+Na]+ 分不开（图 2），但在 80 °C时却能分离（图 3）。要用 LC/MS 区分人参和西洋参，异构体人参皂甙 Rf 和伪人参皂甙 F11 非常有用。对人参的分析显示，质子化和加合形式的人参皂甙 Rf 分别在 m/z 801.5 和 m/z 823.5 处。在 m/z801.5 处的异构体伪人参皂甙 F11 只能作为痕量化合物检测（图 3）。相反，西洋参中却含有大量伪人参皂甙 F11 ，而不含人参皂甙 Rf。