液相色谱“双峰”的5大原因

色谱双峰指的是明明是同一种物质，但在色谱图中却呈现双峰，让实验人员误认为含有两种物质。那么，出现双峰的原因主要有哪些呢？今天小编就和大家聊一聊，液相色谱出现“双峰”的原因。

在HPLC分析中，在色谱柱正常，样品浓度适宜，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下，峰型应对称而尖锐。但在实际操作中，如果对样品不了解，前处理不恰当或者分析方法不合理等，会出现峰形不正常的情况，其中双峰现象就是液相色谱中常见的问题之一。

出现色谱双峰的原因一般有以下几种原因：色谱柱的问题、溶剂、进样量、样品特性，以及pH。

色谱柱

如果在样品分析时发现每个色谱峰都有双峰出现，尤其在采用单一纯物质时，则可以确定是色谱柱出现问题了，一般是柱头受损或者柱头固定相污染引起的。

如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这时可以将进样头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这个对技术要求较高且不能经常做，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效降低而报废。如果上述不能解决问题，可能是柱塌陷造成的，此时需要更换色谱柱。

溶剂问题

目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解，最佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中，有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一点的缓冲液，缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化，从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液，调整溶剂pH值，或者用流动相配置样品。

此外，样品要现配现用，避免样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶剂效应。

进样量

当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主时，如果样品进样量大，如定量管为20ul，此时单一的纯物质会出现双峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一样)，且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的，此情况下需要减少进样量。

另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

样品特性

有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下(如pH值、流动相极性、温度等)，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。

有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC-MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，如农药啶虫眯(吡虫清)。

pH值

体系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上(前面已经提到)，尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时，受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外，在样品分析时，流动相的pH尽量远离被分析物的等电点，否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时，选择不好条件也会容易引起双峰的产生。

HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下（不包括梯度），峰型应对称而尖锐。但是，在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理下，会出现各种意想不到的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此，所以，了解每种鬼峰出现的原因对我们的分析工作是非常重要的。