液质在生物分析中的基本样品制备技术

固相萃取（SPE）

SPE是一种功能强大的样品制备技术，几十年来一直用于各种生物样品中微量分析物的选择性提取和富集。SPE的作用机制与液相色谱法类似，它是基于溶解在液体（流动相）中的溶质（感兴趣的分析物）和吸附剂材料（固定相）之间的亲和性或相互作用。由于物理化学性质的不同，液体样品中的不同组分在SPE器件的固定相中与吸附剂有不同的亲和性或相互作用。通过SPE，液体样品经过适当处理（稀释、pH调整和/或添加IS)后，装载到填充适当吸附材料的预处理/平衡柱/筒/板上；通过不同的吸附材料相互作用（固定相）相互作用被保留；干扰基质组件在加载过程中直接通过柱/筒/板，或在清洗过程中用适当的溶剂清洗；随后用合适的洗脱溶剂从柱/筒/板中洗脱感兴趣的分析物。收集到的洗脱液要么直接进行LC-质谱分析，要么进行干燥过程以蒸发有机溶剂。在LC-质谱分析之前，用适当的溶剂重组或开始流动相。使用SPE，可以预防或最小化与PPT和/或LLE相关的一些问题。这些问题包括但不限于(i)PPT中的基质效应和（ii）LLE中不wanquan相分离导致的恢复较差。SPE产品可从各种供应商处提供各种化学物质、吸附剂、尺寸和格式，以适应不同的样品尺寸和生物分析应用。

SPE固定相（吸附剂）

SPE吸附剂材料通常是不规则形状的刚性颗粒，标称尺寸从8到70μm（最常见的是40-60μm），这允许在加载、洗涤和洗脱过程中样品或溶液通过吸附剂床的合理的流速。SPE吸附材料的较小颗粒需要更高的压力。例外的是板格式的吸附剂材料。由于这种格式的床路径非常短，由于粒径小，所产生的总电阻小于格式化成柱或盒的典型吸附床。大多数SPE材料在本质上是wanquan多孔的。吸附剂材料的小孔隙率与较高的总表面积有关，因此，吸附剂材料的活性吸附容量更高。通常，SPE吸附剂中给定的吸附剂材料的容量约为每质量吸附剂的百分之一（%）保留化合物（例如，5毫克化合物被100毫克吸附剂保留）。SPE吸附剂可大致可分为两大类，即硅基吸附剂和聚合物基吸附剂。

硅基吸附剂：根据定义，硅基吸附剂是通过将不同的官能团与硅结合而制成的，尽管碱基硅在一些SPE工作流程中也起着积极的作用。许多商业上可用的硅基吸附剂都使用首字母缩写来命名。这些首字母缩写描述了二氧化硅上各自官能团的主要特征，包括C18、C8、C6、C4、C2、苯基、环己基、氰丙基、氨基丙基、二乙胺、二醇、丙基磺酸、苯磺酸、丙基羧酸和丙基三甲基胺。基于c18的SPE柱/墨盒/板是非常受欢迎的和最疏水性的。由于其很强的疏水性，它们对许多化合物具有很强的保留性。然而，它可能不能提供好的选择性。为了在SPE中获得更好的选择性，可以使用疏水相较少的SPE柱/墨盒/板，如c8柱，这也非常流行。

无论在制造硅基SPE吸附剂时使用哪种键化学，由于结合官能团的空间因素，残留在吸附剂表面的未反应（或残留的）硅醇种类的数量仍然很高（典型的c18键相的>50%）。这些硅醇物种能够与分析物分子相互作用，往往导致意外的保留效应和较低的提取效率。在溶液的pH ~4中，硅表面约50%的硅醇被电离。因此，可以调整溶液pH，以确保硅烷醇物种的离子抑制（pH≤2）或wanquan电离（pH≥6）。需要注意的是，当暴露在jiduanpH中时，硅吸附剂可能会被水解。在pH值为2时，键合表面易于水解，吸附剂的效率可以大大降低。在pH值为8时，二氧化硅本身易于水解，吸附剂在长期暴露后迅速恶化。

聚合物基吸附剂：各种聚合物基吸附剂在商业面上，涵盖了广泛的极性和化学性质。最常见的聚合物吸附剂是基于苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。通过胺化或磺化的进一步修饰有助于创建离子交换聚合物吸附剂。一些极性官能团的掺入使吸附剂可润湿，这为保留机制提供了额外的可能性。聚合物基固定相的一个重要优点是，即使它们在SPE过程中干燥，它们的化学性质也不会改变，而且用于硅基SPE柱/墨盒/板的初始调节步骤可能不需要。此外，与硅基吸附剂相比，大多数聚合吸附剂在整个pH范围内是稳定的。

LC-MS生物分析中常用的SPE平台

根据各自的保留机制，LC-MS生物分析中常用的SPE可分为三类，即反相SPE、离子交换SPE和混合模式SPE。正相SPE设计用于从有机提取物、极非极性溶剂和油脂等中提取分析物。由于它很少应用于血浆和尿液等生物基质的样品提取，因此不包括在目前的讨论中。

●反相SPE：它采用了硅基或聚合物基吸附剂的非极性固定相，它们保留了大多数具有任何疏水特性的分子。硅基非极性吸附剂的常见官能团包括但不限于C18、C8、C6、C4、C2、C1、苯基、环己基和氰丙基。在这些类群中，短链链（如C1、C2）的保留性较低，而长链（如C18）的保留性较强。与其他类型的SPE相比，反相SPE被认为是最少的选择性保留机制。正因为如此，它对于在同一样本中提取结构非常不同的分析物非常有用。

●离子交换SPE：它利用吸附剂的离子官能团（强或弱有机酸和碱），可以进一步分类为强/弱阳离子/阴离子离子交换SPE：

1. 强阳离子交换（SCX）SPE：吸附剂通常含有磺酸作为离子交换的离子基团。磺酸的pKa值很低，并且几乎在整个pH范围内都带负电荷。

2. 弱阳离子交换（WCX）SPE：吸附剂中通常含有羧酸作为离子基团。羧酸是弱酸，pKa值在4.5-5.0左右，仅在部分pH范围内被电离。如果SPE柱/盒/板中的pH调整到pH值3以上，离子交换器就会逐渐“打开”。相反，如果pH被降低到pH值3以下，离子交换器就会“关闭”。

3. 强阴离子交换（SAX）SPE：吸附剂通常含有季胺基团作为官能团。季胺在整个pH范围内都带正电荷。

4. 弱阴离子交换（WAX）SPE：吸附剂中通常含有仲胺或叔胺作为离子交换的官能团。二胺或叔胺为弱碱基，pKa值为~值10。因此，通过调整pH值>为10，离子交换器逐渐“关闭”。相反，如果pH被调整到远低于pH值为10，即pH值为8或更低，离子交换器就会“打开”。

   ●混合模式SPE：混合模式SPE是一种提取方法，涉及吸附剂表现出两个或更多的主要相互作用，以保留感兴趣的分析物。商业上可用的混合模式吸附剂可以是硅或聚合物基的，通常通过将吸附剂与两个不同的官能团（如C2、C8与硫酸盐）同时结合，或以适当的比例混合离散吸附剂化学，以创建保留性能的组合。常用的混合模式吸附剂具有疏水官能团与离子交换官能团结合。疏水基团可以是短链（如C2)，也可以是长链（如C18)这是高度保留的。离子交换器可以是阳离子取向或阴离子导向的。混合模式SPE允许通过离子和疏水相互作用使化合物保留

一般SPE工作流

从技术上讲，SPE是一种低压色谱法的形式，可以通过LC-MS系统离线或在线进行。在开发基于SPE的LC-MS生物分析样品制备方法时，除了相关分析物的理化性质外，需要考虑的参数包括(i)吸附剂的类型和数量，（ii）样品体积（考虑初始分析、重复分析和发生的样品再分析所需的体积），以及（iii）加载、洗涤和洗脱条件（时间、体积和成分）。

与LC柱类似，各种SPE产品有各种形式的商业。这些包括但不限于一次性墨盒，多孔板（96孔，384孔），和来自一些主要供应商的在线SPE柱。一般来说，每个特定的SPE产品都提供了供应商推荐的程序或方法协议。这些程序或协议应被视为对感兴趣的分析物的预期SPE方法的方法开发的起点。

反相SPE

反相SPE是从水溶液中提取相对非极性分析物的常用方法。

●萃取机理：被分析物与固定相之间的疏水相互作用。通过范德华力，随着分析物的疏水性的增加而增加，这主要是在固定相中的氢碳键和分析物分子中的氢碳键之间。这种相互作用在水相中被促进，但在有机相中被抑制或破坏。

●适用分析物：logP值为>1.0的化合物，可以考虑大多数商业化的硅基或聚合物基反相SPE。然而，对于logP值在−1.0到1.0之间的化合物，最好考虑改性聚合物基反相SPE，因为聚合物基SPE吸附材料的极性改性比硅基C18或C8材料的极性选择性增加；对于logP值为<−0.1的化合物，它们在反相SPE上的保留率较差，一般不推荐反相SPE。

●样品预处理：样品需要用适当的缓冲液或水稀释（对于中性化合物）。对于可电离化合物，pH的调整是重要的，因为感兴趣的分析物(s)的电离状态可以极大地改变其在给定的RP SPE吸附剂上的保留和洗脱特性。一般规则是将样品pH调整到高于（碱性化合物）或低于（酸性化合物）pKa值的2个pH值，以确保化合物在装入SPE柱/盒/板之前被中和。除了常用的缓冲液，一些常见的试剂，如2%甲酸、2%羧酸、2%乙酸、TFA、磷酸或氢氧化铵、碳酸氢钠、碳酸钠，可用于样品处理。

●活化：吸附剂调节是“激活”或“湿”SPE吸附剂，以确保感兴趣的分析物(s)与SPE吸附剂的官能团之间的一致相互作用。最常见的调节方法是将一到两体积的水混溶有机溶剂（通常是甲醇或乙腈）应用于反相吸附剂。随后，通过引入一种在溶剂强度和pH方面类似于样品装载的溶液来平衡SPE吸附剂，以最大限度地保留对SPE吸附剂感兴趣的分析物。一到两体积的缓冲液（与样品预处理相同）或水（对于中性化合物）是平衡反相吸附剂的常用选择。

●装样：装样的关键因素是样品通过SPE吸附剂时的线速度，以确保最佳保留。对于离线应用，样品通常被允许通过自然重力流动，以确保样品与感兴趣的分析物(s)与固定相的接触时间。水样可以直接加载到平衡的反相SPE柱/筒/板上。被分析物的非极性性质导致了与SPE吸附剂的固定相的疏水相互作用的强保留。

●洗涤：生物样品基质中的干扰化合物通常与感兴趣的分析物共同保留在反相SPE柱/盒/板上。洗涤的目标是选择性地去除不需要的基质成分，同时将感兴趣的分析物(s)保留在SPE吸附剂上。在洗涤步骤中，通常首先使用纯水或缓冲液来去除水溶性干扰（例如，极性化合物或盐），对SPE吸附剂没有亲和力。随后使用溶剂，通常是比水或缓冲液洗脱强度更高的甲醇水溶液，尽可能清洗样品，但不清洗感兴趣的分析物。这将需要一定程度的评价和/或优化，在此期间，通过增加有机溶剂的百分比，对洗涤液进行分析，以确定和/或确认洗涤溶剂的最佳强度。一般来说，感兴趣的分析物的logP值越高，其与反相SPE吸附剂材料的相互作用越强，洗涤溶剂也越强。一个很好的估计是，感兴趣的分析物的logP值每增加一个单位，将松散地对应于洗涤溶液中甲醇（在水中）中10%的增加10%。例如，睾酮的logP值为3.37，在洗涤溶剂中使用35%的~甲醇可以在最小的背景干扰下获得分析物的最佳回收率。为了有效地优化洗涤溶液，其强度在估计百分比（例如35%甲醇）附近的溶剂可以是一个很好的起点，将其与±10%（即25、35和45%）的甲醇包起来。

●洗脱：洗脱是为了破坏具有有机溶剂（如甲醇或乙腈）或溶剂组合的反相SPE吸附剂的官能团之间的所有疏水相互作用。否则，可能会发生部分洗脱。部分洗脱通常与不可重复的LC-MS结果和感兴趣的分析物的REC较差和不一致有关。一般来说，较高的logP值化合物需要更强的溶剂或溶剂组合，才能获得最高的REC和zuidi的洗脱体积。因此，在反相SPE中，极性较低的溶剂是一种较强的洗脱溶剂。换句话说，选择一个更非极性的溶剂会得到更好的结果。如果分析物(s)是碱性或酸性化合物，应调整洗脱溶剂的pH值以给分析物(s)充电，从而进一步减少疏水相互作用。在这种情况下，使用较弱的洗脱溶剂和/或减少洗脱体积可能是可行的。在实践中，洗脱过程中一致和低流量通常与提高回收率和重现性有关。洗脱步骤被认为是样品清理的额外机会。使用一个非常强的洗脱溶剂经常导致干扰的洗脱与感兴趣的分析物。因此，洗脱步骤应该使用尽可能弱的溶剂，提供分析物(s)的wanquan洗脱，但在最终洗脱液中没有或最小的干扰化合物。在这方面，洗脱液的优化应通过逐步降低洗脱溶剂的强度，从高（如100%甲醇）到低，并监测洗脱液中的回收率和基质效应。

●直接LC-MS分析洗脱液或蒸发，然后重建产生的残留物进行LC-MS分析：在反相SPE中，如果反相洗脱液比起始流动相少，则所得洗脱液可以进行直接LC-MS分析。然而，在许多应用中，在反相LC-MS分析之前，需要蒸发有机溶剂并使用起始流动相复溶产生的残留物。