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【瑞士步琦】【应用】运用带有ELSD和UV双检测器的Pure系统快速纯化各种范围的多肽
运用Pure系统
快速纯化各种范围的多肽
Pure应用
”
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简介
肽序列的新发现为现代医学提供了新的药物开发候选。天然产物和合成肽的纯化过程是药物开发过程中的重要步骤，通常使用制备型 HPLC 来完成，这可能既昂贵又耗时。Flash 快速制备色谱是纯化合成肽和其他小分子药物的快速且经济高效的方法。使用 Flash 快速制备色谱可以快速增加肽的总体纯度，然后再添加下一个氨基酸或在制备型 HPLC 上进行最终精制。
这项工作证明了使用具有 ELSD 和 UV 检测功能的 Pure 色谱系统可以纯化和回收多种肽。与制备型 HPLC 色谱柱相比，FlashPure C18 柱显示出高负载能力和高分离度的肽纯化能力，单次进样可处理更多量的肽。并且与制备型 HPLC 相比，Flash 快速制备色谱减少了纯化时间和溶剂使用量。
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实验
通过这项工作，我们开始测试Flash快速制备色谱是否对纯化多种肽有任何优势。所以，我们选择肽样品的大小范围从几个氨基酸到长度为32个氨基酸。为了测试装载能力的优势，我们在 12g FlashPure C18、60Å， 40μm 柱子中装载了 30mg–1g 多肽抗生素（多粘菌素B硫酸盐）。
接下来，我们测试了 Pure 快速纯化的能力，以充分混合在分离肽和小氨基酸（牛磺酸（35mg）+万古霉素（45mg）+多粘菌素（56mg）。
样品：
多肽，氨基酸和多肽抗生素（Sigma Aldrich）
合成肽混合物（California Peptide Research, Inc）
设备：
Pure 分离纯化系统（BUCHI）
耗材：
Flash Pure C18（BUCHI）
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结果与讨论
评估60Å，40μm C18色谱柱的载样能力
为了测试载样能力，将 30mg–1g 的多粘菌素B硫酸盐装入12g FlashPure C18 中，通常来讲 HPLC 的典型制备上样量为柱子填料量的 0.1- 1.0％。而快速纯化载样数据表明，可加载 0.1–10％ 的样品而不会对色谱柱产生不利影响。这意味着与通常需要多次进样的单独制备型HPLC相比，使用快速纯化可以在一次进样中处理更大量的粗肽。与此同时，可以使用更少的溶剂和更少的时间来纯化大量的样品。Pure 纯化系统的另一个优势是能够使用干法上样方式为低溶解度样品提供更高的负载量。
▲ Polymyxin B 的快速纯化载样数据表明，上样量可达分离柱质量的 0.1–10％，而对回收率没有不利影响。
评估多肽混合物的分离
包含两个多肽（万古霉素和硫酸多粘菌素B）和一个小氨基酸（牛磺酸）的测试混合物证明了 Pure 快速纯化系统能够充分分离肽混合物的能力。结果表明，使用 60Å，40μm C18 介质进行快速纯化可充分分离出三种具有对称峰形的化合物。UHPLC证实了万古霉素和硫酸多粘菌素B的纯度均高于 98％。混合物在10分钟内纯化，这比使用制备型 HPLC 纯化相同混合物快约4倍。除此之外，结合了 UV 和 ELSD 双检测器系统的另一个好处是，可以检测和收集未反应的氨基酸片段和无紫外吸收产物。以此为例，牛磺酸仅被 ELSD 检测到。
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结论
结果表明，Pure 系统与反相 C18 色谱柱的结合使用可成功用于纯化多种从单个氨基酸到大肽的肽段（接近5000 MW）。根据图谱显示，Pure 分离纯化系统可以单独使用，也可以在制备型 HPLC 之前用作预纯化步骤，这可以提高肽段纯化过程的效率。数据表明，样品的上样量可达到快速色谱柱填料量的 10％，并使用快速色谱法成功纯化。这意味着，与通常需要多次进样的单独制备型 HPLC 相比，使用快速纯化在一次进样中可以在更短的时间内处理大量的粗肽。自动快速色谱的另一个好处是能够使用干法上样的进样技术为低溶解度的样品提供更高的负载量。将 UV 和蒸发光散射检测（ELSD）结合使用的另一个优点是，可以检测和收集未反应的氨基酸片段和无紫外吸收的产物。
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