SEC分析中样品吸附的改善：色谱柱的预处理

SEC分析中样品吸附的改善：色谱柱的预处理

Wyeth BioPharma公司在一项方法优化与研究中发现，在对从细胞培养原料中经多步正交纯化得到的表观分子量为140 kDa的蛋白质的各组分进行SEC分析时，使用BSA（牛血清白蛋白）对色谱柱进行预处理，显著提高了重现性和回收率。

Wyeth BioPharma在三步细胞培养纯化的每个阶段都会采用SEC分析，以确定目标蛋白中高分子量物质的纯度和回收率。细胞培养物通过蛋白A亲和层析以及后续的精制步骤进行纯化。在蛋白A洗脱后片段的SEC分析中，高分子量物质区域的洗脱峰回收率和重现性差异很大，这表明样品可能吸附在填料上。为了减少这种差异，实施了用BSA进行预处理的实验方案。

分析条件

色谱柱：        TSKgel G3000SWXL（7.8 mmI.D.×30 cm, 5 μm）

流动相：        磷酸盐缓冲液（pH 6.5）

样    品：        进样量50 μL，进液50 μg

检    测：        UV@280 nm

进样量：        10 µL

结果与讨论

如图1所示，蛋白A纯化样品在高分子量区域的回收率（%HMW）仅为1.1%。在向色谱柱中注入10份、每份20 μL、浓度为5 mg/mL的BSA后，回收率提高到了3.5%。在未进行BSA处理的情况下，从以往的数据来看，使用新色谱柱时的蛋白A纯化样品的%HMW值为1.0%～1.4%，而在进样多达60次后，该值会逐渐上升至3.5%～4.0%。有趣的是，这一结果仅在蛋白A纯化样品中表现明显。

图1  BSA处理前后的蛋白A样品的叠加图

表1  BSA处理前后的全部三种样品的回收率

如表1所示，BSA预处理对从下游层析步骤中获得的样品没有影响。进一步的表征分析表明，与精制后的样品相比，蛋白A纯化样品中存在较高水平的宿主细胞蛋白（HCP）。研究发现，这些HCP在SEC分析图谱的HMW区域被洗脱出来。此外，当对BSA处理后的蛋白A纯化样品进行SEC分析时，发现与BSA处理前对同一样品进行SEC分析时的结果相比，经BSA处理后的样品在HMW区域中的宿主细胞蛋白含量更高。这表明，样品与色谱柱填料之间的相互作用在HCP上表现得最为普遍，而非目标分子的HMW物质。

研究结论

用BSA对SEC柱进行预处理可以减少二次相互作用并提高分析间结果的一致性。在这个特定的实验方案中，与下游纯化步骤（精制步骤1和步骤2）中HMW回收率未受影响的情况形成对比的是，蛋白A纯化组分在结果一致性方面有了显著改善，这为进一步表征蛋白A纯化样品中的高分子量组分提供了契机。这一表征工作得出的结论是，对从早期纯化步骤所得样品进行SEC分析的结果，可能会受到源自细胞培养环境的非产品相关杂质的不利影响。

参考文献

1.       Y. Kato et al; J. of Chromatrogr.404 (1987) 333-339