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破解 GLP‑1 多肽吸附难题｜Frontier 生物惰性液相‑质谱联用
多肽是由多个氨基酸通过肽键连接形成的化合物。一般指2-100个氨基酸缩合而成，分子量大致200-10000 Da。以司美格鲁肽和替尔泊肽为代表的长链多肽，作为新一代治疗糖尿病的药物，不仅可以有效刺激体内胰岛素的释放，控制血糖水平，还可以抑制肠胃蠕动，控制食欲。它们在降糖，减重等方面表现出了良好的临床优势。这类GLP-1类药物其口服利用度非常低，需要高灵敏度高选择性的分析方法，通常采用高效液相色谱串联质谱法进行定性定量检测。而由于其分子量大、多条肽键、含大量疏水氨基酸并同时带电荷，极易吸附残留。LC-MS上表现为进空白溶剂仍出峰、交叉污染和峰保留时间逐步漂移等现象。针对多肽类药物在色谱端残留大的问题，科诺美现推出Frontier生物惰性超高效液相色谱系统（Frontier Bio Inert LC），该系统与质谱仪联用，可以大大减少乃至消除非特异性吸附，有效提高检测精准度；无需钝化处理系统，提高仪器使用效率，为多肽类药物测定提供优质解决方案。
液相方法：
色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 2.1*100 mm 1.7μm
流动相：A：水（含0.1%甲酸）；B：乙腈（含0.1%甲酸）
梯度洗脱：0.01-0.5min，30%B；0.5-3.0min，30%B-65%B；3.0-3.5min，65%B；3.5-4.0min，65%B-98%B；4.0-5.5min，98%B。
流速：0.3mL/min
柱温：65℃
进样量：5μL
质谱方法：
数据采集方法：MRM（多反应监测）
离子源：ESI正模式
气帘气CUR：35psi IS电压：5500V
源温度TEM：450℃ 雾化气GS1：60psi
辅助气GS2：60psi 碰撞气CAD：high
表1 Semaglutide和Tirzepatide的MRM离子对信息
混合标准储备液：分别称取适量司美格鲁肽和替尔泊肽标准物质用50%乙腈水配制成1mg/mL的混合标准溶液。
混合标准工作液：将上述标准储备液用50%乙腈水稀释成浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的混合标准工作液，现配现用。
按照空白-500ng/mL-空白1-空白2的进样顺序编辑序列，运行结束后根据目标峰的峰面积计算500ng/mL浓度之后的第一针和第二针空白的残留水平，结果如表2所示。生物惰性仪器500ng/mL后空白1残留%比普通Frontier残留减少约57%。
表2 普通Frontier和生物惰性Frontier Bio Inert 仪器残留对比表（以峰面积计算）
Frontier Bio inert LC系统新增多种自动进样器清洗方式，更适配易残留的多肽检测，通过增加针清洗和阀清洗等方式残留可降至0.1%以内。
表3 生物惰性Frontier Bio Inert 不同进样器清洗程序仪器残留对比表（以峰面积计算）
图 1 线性最高点浓度500ng/mL司美格鲁肽和替尔泊肽总离子流图（TIC）
图 2 司美格鲁肽500ng/mL以及空白1残留叠加图
图 3 替尔泊肽500ng/mL以及空白1残留叠加图
将司美格鲁肽和替尔泊肽混合标准工作液1.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，50.0ng/mL，100.0ng/mL，200ng/mL，500ng/mL分别进样分析。司美格鲁肽和替尔泊肽线性结果如图4所示，在1.0ng/mL~500ng/mL范围内线性良好，r2均大于0.999。
图4 Semaglutide和Tirzepatide的标准曲线结果
将100ng/mL的样品连续进样6次进行重复性考察。保留时间重复性在0.07%-0.09%之间，峰面积重复性在1.24%-1.80%之间，结果如图5和图6所示。
图5 司美格鲁肽100ng/mL连续6针重复性结果表
图6 替尔泊肽100ng/mL连续6针重复性结果表
本方案采用科诺美Frontier生物惰性超高效液相色谱系统（Frontier Bio Inert LC），该系统与质谱仪联用，采用新的自动进样器清洗方式，可以有效减少乃至消除非特异性吸附，线性最高点500ng/mL后空白残留在0.1%以内，在浓度范围1ng/mL-500ng/mL内线性良好，线性相关系数大于0.999，重复性好，满足多肽类药物的测定要求。
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