葛根品质评价的技术革新——NY/T 4307-2023《葛根中黄酮类化合物的测定 高效液相色谱-串联质谱法》全解读

一、标准概述

葛根，为豆科葛属植物野葛（Pueraria lobata）或粉葛（Pueraria thomsonii）的干燥根，是我国传统的药食同源植物。葛根中富含多种黄酮类活性成分，其中以葛根素最为著名，此外还有大豆苷、大豆苷元、染料木素等多种黄酮类化合物。这些黄酮类成分具有抗氧化、降血糖、改善心脑血管功能等多种生物活性，是葛根品质评价的核心指标。

NY/T 4307-2023《葛根中黄酮类化合物的测定 高效液相色谱-串联质谱法》 是由中华人民共和国农业农村部发布的一项农业行业推荐性标准。该标准于2023年2月17日发布，2023年6月1日正式实施。标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

该标准由农业农村部农产品质量安全监管司提出，由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口。起草单位为北京工业大学、浙江省农业科学院、广西壮族自治区农业科学院。主要起草人包括张芳、齐沛沛、王颖、王雨婷、智美丽、裴鹭羽、李宜珊、严华兵、尚小红等。标准总页数为10页。

该标准的中国标准分类号为B 04，国际标准分类号为65.120（饲料）。标准英文名称为“Determination of flavonoids in the root of kudzu vine—High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)”。

二、方法原理

NY/T 4307-2023所采用的核心技术是高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, HPLC-MS/MS）。

其基本原理可概括为以下步骤：

第一步：提取——葛根样品中的黄酮类化合物用乙醇水溶液进行超声提取。超声提取利用超声波的空化效应加速溶剂渗透和溶质扩散，实现目标化合物的快速高效提取。

第二步：净化与过滤——提取液经离心分离后，取上清液用0.22 μm有机相滤膜过滤，去除颗粒物杂质，保护色谱柱和质谱仪免受污染。

第三步：色谱分离——净化后的样品溶液注入高效液相色谱系统，以C18反相色谱柱进行分离。采用梯度洗脱方式，以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相，11种黄酮类化合物在9分钟内实现良好分离。

第四步：质谱检测——分离后的各化合物依次进入串联质谱仪。采用电喷雾电离（Electrospray Ionization, ESI）技术将液相流出物中的待测物离子化，再以多反应监测（Multiple Reaction Monitoring, MRM）模式采集数据。MRM模式通过选择特定母离子→子离子对进行监测，大幅提升了检测的选择性和灵敏度，是痕量定量分析的首选模式。

第五步：定量——采用外标法定量，通过比较样品中各化合物峰的保留时间和质谱离子对信息与标准品的一致性进行定性，通过峰面积进行定量。

这一方法的核心优势在于高效液相色谱与串联质谱的联用：液相色谱提供了优异的分离能力，串联质谱则提供了极高的灵敏度和选择性，两者结合使该方法能够在复杂葛根基质中同时准确定量11种黄酮类化合物。

三、试剂与材料

标准对实验用试剂和材料有严格规定。

用水要求：实验用水应符合GB/T 6682规定的一级水。一级水是最高纯度的实验用水，电阻率通常不低于18.2 MΩ·cm，可有效避免水中杂质离子和有机物对痕量分析的干扰。

试剂规格：除非另有规定，所用试剂均为分析纯。其中，甲醇和甲酸应为色谱纯。

主要试剂：

溶液配制：

·         10%甲醇溶液：取10 mL甲醇，加水定容至100 mL

·         30%乙醇溶液：取30 mL乙醇，加水定容至100 mL

标准品：11种黄酮类化合物标准品（葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素和鹰嘴豆芽素A），纯度均不低于98%。

标准溶液配制：

·         标准储备液：准确称取11种待测物质的标准品，用甲醇溶解后，加入10%甲醇溶液定量稀释，制成高浓度单标准品储备液

·         混合标准工作液：根据检测需要，将各标准储备液混合稀释成系列浓度的混合标准溶液

四、仪器与设备

标准要求配备以下核心设备：

关键色谱条件：

·         色谱柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）或性能相当者

·         柱温：40℃

·         流速：0.3 mL/min

·         进样量：2 μL

·         流动相：甲醇和0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱

关键质谱条件：

·         电离方式：电喷雾电离（ESI），正负离子切换模式

·         离子化电压：正离子模式3.5 kV，负离子模式2.5 kV

·         毛细管温度：350℃

·         雾化气和辅助气：氮气

·         碰撞气：氩气（纯度99.99%）

·         采集模式：多反应监测（MRM）

五、分析步骤

1. 试样制备

新鲜葛根需清洗、去皮、切片后，于60℃烘干至恒重，然后粉碎至40~60目，混匀备用。

2. 样品前处理

前处理是保证检测结果准确性的关键环节，具体流程如下：

·         称样：准确称取葛根粉末0.5 g（精确至0.001 g），置于50 mL离心管中

·         提取：加入10 mL 50%乙醇溶液，室温下超声提取20分钟

·         离心：以4 000 r/min离心5分钟

·         转移：将上清液转移至25 mL容量瓶中

·         洗涤：沉淀用10 mL 50%乙醇溶液洗涤两次，合并上清液至同一容量瓶

·         定容：用50%乙醇溶液定容至25 mL

·         过滤：上样前用0.22 μm有机相滤膜过滤

3. 色谱-质谱分析

将过滤后的样品溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪，在优化的色谱和质谱条件下进行分离和检测。11种黄酮类化合物在9分钟内实现分离。

4. 标准曲线绘制

将11种黄酮类化合物的混合标准溶液逐级稀释成一系列浓度的标准工作液，分别进样测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线相关系数应不低于0.995。

5. 定性定量方法

定性：样品色谱峰的保留时间与标准品一致（变化不超过±2.5%），且质谱离子对的相对丰度偏差符合规定要求（相对丰度>50%时偏差±20%，20%~50%时±25%，10%~20%时±30%，≤10%时±50%）。

定量：采用外标法，根据样品峰面积从标准曲线上查得相应浓度。若超出线性范围，需稀释后重新测定。单点校准浓度差不超过30%。

6. 结果计算

结果按公式计算，平行测定取算术平均值，保留三位有效数字。

六、方法学验证

根据标准及相关资料，该方法具有良好的分析性能。

检出限与定量限：

精密度要求：

·         重复性：在重复性条件下，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%

·         再现性：在再现性条件下，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的30%

七、方法优势与应用价值

NY/T 4307-2023所规定的高效液相色谱-串联质谱法具有以下显著优势：

1. 高通量、高效率：该方法可在一次进样、9分钟内同时完成11种黄酮类化合物的定性和定量分析。相比传统方法逐一测定不同成分，大幅提升了检测效率。

2. 高灵敏度：串联质谱的MRM模式具有极高的检测灵敏度，各化合物的检出限低至0.03~0.1 mg/kg，能够满足葛根中微量黄酮类成分的准确测定需求。

3. 高选择性：液相色谱-串联质谱联用技术结合了色谱的分离能力和质谱的质量分辨能力，即使在葛根这样复杂的天然产物基质中，也能准确识别和定量目标化合物。

4. 覆盖面广：标准覆盖了葛根中葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、刺芒柄花苷、刺芒柄花黄素、异甘草素和鹰嘴豆芽素A等11种主要黄酮类化合物，全面反映了葛根的品质特征。

5. 填补标准空白：该标准是我国葛根中多种黄酮类化合物同步测定的专项方法标准，为葛根的质量控制、资源开发和产品评价提供了统一的技术依据。

6. 适用范围明确：标准适用于野葛和粉葛两种主要基原，覆盖了我国葛根药材和食品原料的主要来源。

八、注意事项

在实际应用中，检测人员需特别注意以下几点：

1. 标准品的保存：标准品需避光保存，母液应于-20℃下保存。混合标准溶液应现用现配，避免因反复冻融或长时间存放导致降解。

2. 样品前处理的把控：烘干温度应控制在60℃，避免温度过高导致黄酮类化合物降解。提取过程应在室温下进行，避免加热引起的成分变化。

3. 用水和试剂质量：必须使用GB/T 6682规定的一级水；甲醇和甲酸应为色谱纯。试剂中的杂质可能影响色谱分离效果和质谱检测的灵敏度。

4. 色谱柱的平衡与维护：色谱柱使用前需充分平衡，梯度洗脱结束后需后运行平衡。C18色谱柱对流动相条件和样品洁净度敏感，应确保样品过滤充分，延长柱寿命。

5. 质谱参数的优化：质谱参数（如离子化电压、毛细管温度、碰撞能量等）需根据实际仪器的状态进行适当优化。不同品牌和型号的仪器可能存在差异，检测人员应建立适合自身仪器的最优参数。

6. 干扰峰的排除：当出现干扰峰时，可通过改变梯度洗脱程序或选择特征离子对的方式加以排除。

7. 标准品的来源与纯度：标准未指定特定标准品来源，但要求纯度不低于98%。检测人员应选择有证标准物质或经严格标定的标准品。

九、总结

NY/T 4307-2023《葛根中黄酮类化合物的测定 高效液相色谱-串联质谱法》以高效液相色谱-串联质谱法为核心技术，为葛根中11种主要黄酮类化合物的同步测定提供了一套科学、规范、高灵敏度、高选择性的分析方法。该标准由农业农村部发布，汇聚了北京工业大学、浙江省农业科学院、广西壮族自治区农业科学院等单位的科研力量，具有较高的权威性和技术先进性。

葛根作为重要的药食同源植物，其黄酮类成分的含量是评价品质的核心指标。该标准的发布和实施，有效统一了葛根中黄酮类化合物的检测方法，填补了我国葛根品质评价领域的方法空白，为葛根的质量控制、产品开发和国际贸易提供了有力的技术支撑。

对于葛根种植企业、加工企业、检测机构和食品安全监管部门而言，深入理解和正确应用这一标准，不仅是满足合规要求的必要前提，更是提升葛根产品质量、促进产业高质量发展的的重要手段。随着消费者对天然产物功能成分关注度的不断提高，该标准在葛根产业的品质评价和标准化发展中必将发挥越来越重要的作用。检测人员应严格按照标准规定的操作步骤和仪器条件开展检测工作，确保检测结果的准确性和可靠性。