CAD检测器关于蛋白药物中吐温 20 的测定

1、引言吐温20的化学成分是聚山梨醇酯20。它是一种非离子型表面活性剂，可用作乳化剂、分散剂、增溶剂和稳定剂。在生物制药行业中，聚山梨醇酯常用作蛋白乳化剂，如胰岛素制剂，可减少蛋白质之间原有的相互作用且不破坏蛋白。作为药用辅料，应该按照国家标准和行业标准，严格控制吐温的用量，避免过量使用吐温导致溶血等不良后果。本文以弱阴离子交换小柱为分析柱，CAD 为检测器，分离检测蛋白药物中的吐温 20

2. 样品前处理a) 样品以 2.5 mL 水溶解后，直接进样。b) 用水溶解吐温 20 对照品，配置成不同浓度后用于标准曲线的测定

4. 结果与讨论:

（1）流动相选择分别采用异丙醇、甲醇、乙腈作为有机相进行洗脱试验。以甲醇为有机相导致聚山梨醇酯 20 色谱峰分叉，影响定量结果。以乙腈为有机相，相同浓度的峰高响应值及峰形均与异丙醇分析得出的结果相似。考虑到聚山梨醇酯 20 在乙腈中的溶解度，以及过高的乙腈会导致蛋白变性，最终选择异丙醇做有机相。质谱检测结果表明，当流动相中异丙醇少于20%时，死体积处的色谱峰中含有少量未与脂肪酸键合的聚乙氧基山梨糖醇（见图11中1号峰）。当异丙醇含量高于 25% 时，聚山梨醇酯 20 洗脱成一个单峰。为了让蛋白和其他赋形剂带上正电荷，与 MAX 色谱柱产生离子排斥作用并死体积洗脱，将流动相调节至低 pH 值。同时，低 pH 值下乙酸等酸性化合物变成中性分子化，不能与色谱柱发生离子交换，较快的从色谱柱中洗脱，避免干扰到聚山梨醇酯 20 的分离检测。 

（2）检测器选择及条件优化分别考察了以 RI、ELSD 和 CAD做检测器对定量分析结果的影响。在示差折光检测器中，只能采用等度洗脱，分析时间较长且灵敏度较低。采用蒸发光散射检测器分析时，Daniel Hewitt 等发现在进样 5-10 针后，基线噪音开始显著增加，峰面积减少，需要采用阀切换技术才能解决这一问题。为了避免以上问题，本文以 CAD 为检测器，参照 Christopher C 等和 Crafts C 等在文献中报道的方法对检测器进行优化。分别采用 20、25、30 和 35 ℃作为氮气雾化温度进行比较，发现聚山梨醇酯 20 的保留时间与响应差别不大。由于 30 ℃更接近于洗脱的柱温条件，最后选用 30 ℃作为雾化温度。同时，对采集频率 2 Hz、5 Hz 和 10 Hz 进行比较，随着采集频率增加，响应信号增加的同时，基线噪音也大大增加。在满足色谱峰大于 30 个数据点的情况下，选用 5 Hz 作为检测器的采集频率。 

（3）标准曲线分析结果取聚山梨醇酯 20 标准工作溶液，按“4(2)”节色谱条件进行测定，标准工作溶液色谱图见图 11。以检测器检测到的电流值（pA）与峰宽（min）的乘积，即峰面积（pA* min）为纵坐标 Y，聚山梨醇酯 20 浓度（μg/mL）为横坐标 x，作线性拟合（见图 12），得线性回归方程为 Y=6.6429 X - 0.0445，相关系数（r）为 0.999。方法定量限（以信噪比 S/N=10 计）为 1.1 μg/mL。线性范围为 9.4-188.0 μg/mL。

5. 前景与展望本实验建立了蛋白类药物，如某人源化单克隆抗体中聚山梨醇酯 20 的含量测定方法。经过精密度、重复性、线性等方法学考察，表明本方法准确度高，精密度、重现性好，在 9.4-188 μg/mL 范围内，线性相关较好（r = 0.999），定量限低至 1.1 μg/mL，可作为药物及制剂中聚山梨醇酯 20 的含量测定方法。CAD 作为质量型检测器，当需要检测更低浓度样品，可以通过适当增大进样体积，或进行柱后有机相补偿，提高化合物的响应，降低定量检出限。同时，由于该检测器响应因子一致，可以通过聚山梨醇酯 20 的浓度同步对蛋白类药物进行初步半定量分析。总体而言，该方法设计巧妙，原理新颖，操作使用方便，取得了较理想的结果，因此具有较好的推广与借鉴意义