人免疫球蛋白G糖基化的高灵敏度高重现性分析

前言作为一大类新型药物，抗体代表了重组产生的治疗性蛋白中最大的一类。这些治疗剂的疗效与其糖基化模式正确与否高度相关，迄今为止，所有获得许可的治疗性单克隆抗体 (mAb) 均是免疫球蛋白 G (IgG)1。因此，糖基化模式分析是质量保证/质量控制 (QA/QC) 过程的一个重要部分。此外，患者血浆中 IgG 的糖基化模式可以反映其健康状态2。人 IgG含有一个保守的 N-连接糖基化位点，它位于每条重链 Fc 区的 Asn-297 位3。这使得每个 IgG 分子含有高度异质性的两个糖基，并会产生至少 30 种糖型的混合物1。血浆中的人 IgG N-连接多糖主要为二天线复合型结构，大多数包括核心岩藻糖并具有 0-2 个半乳糖残基和 1-2 个唾液酸。此外，人 IgG 还携带有少量的二等分 N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc) 残基。一般而言，缺失非岩藻糖化或二等分 GlcNAc多糖结构，基本不会降低重组单克隆抗体(mAbs) 的模式复杂性4。同时，还发现了其他更多未成熟结构，例如像 mannose-5一样的高甘露糖型结构，虽然它们的量大都较低5。

蛋白糖基化模式的分析挑战性，特别是因为复杂生物样品中多糖分析物的丰度常常很低。利用亲水相互作用色谱(HILIC)-HPLC 结合荧光检测器分离 AB 标记的多糖结构是一种稳定、灵敏的多糖分析方法6。在本应用简报中，我们使用了这种方法并检验了其精密度、线性和灵敏度。图 1 显示了本应用简报中所用的多糖结构、亚型及命名，它们也曾用于之前的出版物中7。根据所连的末端半乳糖残基数量，将与 IgG 连接的多糖划分成不同的亚型，如图 1b 所示。G0、G1 和 G2 分别含有 0、1 和 2 个末端半乳糖残基。

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实验部分实验中所用的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统包括以下模块：• Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵(G5611A)• Agilent 1260 Infinity 高性能生物惰性自动进样器 (G5667A)• Agilent 1290 Infinity 自动进样器控温器 (G1330B)• Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C)• Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测器 VL (G1315D)，配有生物惰性标准流通池，10 mm• Agilent 1260 Infinity 荧光检测器(G1312B)，配有生物惰性 FLD 流通池色谱柱TOSOH TSK-GEL Amide-80 色谱柱，2 ×150 mm，3 µm软件Agilent OpenLAB CDS，用于 LC 及 LC/MS 系统的 ChemStation 版本，Rev.C.01.02 [14]溶剂及样品缓冲液 A：100 mM 甲酸铵溶液，pH 4.5缓冲液 B：乙腈

多糖标准品• GLYKO2-AB（- 人IgGN-连接多糖文库），200 pmol• GLYKO 2-AB-(MAN-5) & Man5，100 pmol• GLYKO 2-AB-(NA2) & G2，100 pmol• GLYKO 2-AB(A1) & G2S1，100 pmol• GLYKO 2-AB-(A1F) & G2FS1，100 pmol• GLYKO 2-AB-(A2) & G2S2，100 pmo

所有的多糖标准品均溶于 50 µL 100 mM的甲酸铵溶液，pH 值为 4.5。所有的溶剂均为 LC 级。超纯水由配有0.22 µm 使用点折叠膜滤芯 (Millipak) 的Milli-Q Integral 系统现制。甲酸铵购自西格玛奥德里奇公司（美国圣路易斯）。AB 标记的多糖标准品购自 Prozyme 公司（美国海沃德）。

结果与讨论AB 标记的人 IgG 标准品 N-多糖的可重现分析图 2 为 AB 标记的人 IgG N-连接多糖文库的色谱分离图。存在于人 IgG 中的所有主要的多糖结构均得到了很好的分离。对于峰标记，采用多种文献中的命名法 3, 8, 9。所有主要的多糖均核心岩藻糖化，具有 0、1 或 2个半乳糖基化结构，具体见表 1。除了单唾液酸化的 G2FS1（最后一个峰）之外，所有的多糖均为中性结构。

使用人 IgG N-连接多糖文库，我们测定了 5 次连续进样的保留时间和峰面积的精密度。所有多糖结构的保留时间精密度均低于 0.16%，峰面积精密度在 0.66% 到4.11% 之间，具体见表 2。所有测得的保留时间和峰面积的 RSD 值均在通常报道的范围内10。线性将 5 种多糖标准品（Man5、G2、G2S1、G2FS1 及 G2S2）的混合物按 1:3 比例连续稀释，得到 0.008 至 1 pmol 的浓度范围，然后计算线性。图 3 为 5 种 N-多糖混合物的色谱分离图，其中柱上样量为1 pmol。

信噪比 (S/N) 为 3 时，检测限 (LOD) 在 10到 15 fmol 之间。信噪比 (S/N) 为 10 时，定量限 (LOQ) 在 34 到 51 fmol 之间。所有校正曲线均具有良好的线性，相关系数均大于 0.999，具体见表 3。FLD 检测器的光电倍增管 (PMT) 增益设为 14 以提高灵敏度。此外，使用 Agilent 1260 Infinity 荧光检测器分析多达 4 种不同的激发和发射波长时，需要对方法进行优化，最终设置激发波长为260 nm，发射波长为 430 nm。这种组合波长相比多糖分析中常用的波长（例如Anumula 200511 中所推荐的）所得的峰强度要高得多。

结论本应用简报证实了对于AB 标记的人 IgGN-连接多糖，配有荧光检测器的 Agilent1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统是实现其高灵敏度高重现性 HPLC 分析的理想系统。人 IgG N-连接多糖文库的分析表明，所有主要的多糖结构均得到了良好的分离。保留时间精密度低于 0.16%，峰面积精密度在 0.66% 和 4.11% 之间。所有测得的保留时间和峰面积的 RSD 值均在通常报道的范围内10。根据 Campbell 等人12 提出的结构指认软件可知，保留时间的高精密度对于正确指认多糖结构具有极其重要的意义。

 5 种多糖标准品（Man5、G2、G2S1、G2FS1 及 G2S2）的混合物按 1:3 的比例连续稀释，得到 0.008 至 1 pmol 的浓度范围，然后计算线性。所有校正曲线均具有良好的线性，相关系数均大于 0.999。检测限 (LOD) 在 10 到 15 fmol 之间，定量限 (LOQ) 在 34 到 51 fmol 之间。优化 Agilent 1260 Infinity 荧光检测器的荧光波长后，峰强度更高，并因此使所得的信噪比更佳。其中，激发波长并没有使用 330 nm（由 Anumula 200512 推荐），而是使用了更低的 260 nm。配有荧光检测器的 Agilent 1260 Infinity生物惰性四元液相色谱系统是对 2-AB 衍生的 N-连接多糖进行高灵敏度高重现性HPLC 分析的*佳系统。