三重串联四极杆质谱进行多种药物血浆稳定性的快速方法

 引言稳定性差的化合物往往生物利用度低。特定官能团（如酰胺、酯以及内酯等）有利于使化合物成为血浆酶（如水解酶和酯酶）的靶标。对新化学实体（NCE）血浆稳定性曲线的研究有助于对其分子结构进行修饰以改善物理化学性质，并且可为后续研究开发选择更适合的分子。本研究中，快速分离 LC/MS/MS 用于研究十种药物化合物的血浆稳定性。其中包括四种β受体阻滞剂（阿替洛尔、拉贝洛尔、美托洛尔和普萘洛尔）、一种钙通道阻滞剂（维拉帕米）、一种 5-羟色胺受体激动剂和四种抗抑郁药（奈法唑酮、去甲替林、丙咪嗪和曲米帕明），该分析采用利血平作为内标。尤卡托品是一种眼科药物，被用作对照样，以美托洛尔为内标进行分析。

实验部分试剂和药品阿替洛尔、拉贝洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、奈法唑酮、去甲替林、丙咪嗪、曲米帕明、维拉帕米、尤卡托品和利血平购自印度班加罗尔的 Sigma-Aldrich公司。HPLC 级乙腈和甲醇均购自 Lab-Scan公司。甲酸购自 Fluka 公司。用于方法开发的目标分析物的储备液和标准溶液用甲醇进行配制。

样品制备血浆用 0.1M 的盐酸或 0.1M 的氢氧化钠调节 pH 值到 7.4。待测化合物溶解在 DMSO（二甲基亚砜）中，终浓度为 10mM，然后用 DMSO 稀释至 40µM。孵育实验中待测化合物的浓度为 1µM，DMSO 的终浓度为 2.5%。将 195µL 的血浆加入一个 96 孔板，然后分别加入 5µl 待测化合物。加标血浆样品于 37°C 孵育 2 小时。分别在0、15、30、60 和 120 分钟时加入 400µL 利血平（内标）甲醇溶液终止反应。同时，含有尤卡托品（对照化合物）的血浆样本加入 400µL 美托洛尔（内标）甲醇溶液终止反应。此外，将仅含内标的甲醇溶液加入血浆样品，制备不含任何被分析物或对照化合物的基质空白。样品板在 4°C，2500rpm 离心 45 分钟，上清液转移到一个新的 96 孔板供 LC/MS-MS 分析。

仪器Agilent 1200 系列快速分离液相色谱系统（包括一个微型真空脱气机、二元泵、带温控系统的高性能自动进样器和柱温箱）与 Agilent 6460 三重串联四极杆质谱仪联用。质谱仪为 ESI 模式，采用安捷伦喷射流技术。采用 Agilent MassHunter 工作站（版本 B.02.00）进行数据采集，MassHunter 定量分析软件（版本B.01.04）进行数据分析。采用 AgilentMassHunter Optimizer 软件（B.02.00）优化两个重要的 MS 参数：碎裂电压和碰撞能量。Optimizer 还可给出本研究中丰度最高的 MRM 离子对。

结论本文建立了评价十种药物化合物血浆稳定性的 LC 方法和质谱条件。采用MassHunter Optimizer 软件确认选定母离子的响应强的子离子。该软件也给出了最佳的碎裂电压和碰撞能量。这样，很快地建立了标准品的质谱分析方法。研究表明，本文建立的方法可用于不同种类化合物的血浆稳定性考察。