液质联用仪利用盒式分析技术进行代谢物稳定性研究

 摘要本应用介绍了在 1290 超高性能液相色谱/6460A 串联四极杆液质联用仪上利用极性切换及和盒式分析技术进行代谢物稳定性研究的方法。这种 UHPLC/MS/MS 方法具有以下优点：• 高通量分析（在流动相流速 1.5 mL/min，泵压为 1,100 bar 条件下，保留时间小于0.8 min）• 快速的 MS/MS 分析，周期仅为 114 ms，在极性切换(极性切换速度是 30 ms)的模式下可以采集 6 个 MRM transitions• 优异的峰面积[%]或相对峰面积的相对标准差（RSD）精度[%]，即使对于半峰宽为0.37 秒的组分峰，也能得到足够的数据点（至少 9 个数据点）• 使用内标或外标校准曲线得到的结果精度为 90.7%-107.1%• 极性切换模式或单极性模式得到的分析结果（残留原药的百分数，%）接近• 出色的色谱分离度避免了由于源内碰撞解离将代谢物转化成母体药物而导致的定量分析结果偏高。

前言体外药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）研究，例如代谢物稳定性研究，对于早期认识药物体内代谢动力学特征并及时摒弃在药物开发后期会失败的非药物类化合物具有重要意义。因此，需要建立快速分析方法以进行药物发现早期阶段涉及的大量化合物的筛查分析。通常使用盒式分析和快速 LC/MS/MS 方法进行代谢物稳定性评估研究。在盒式分析过程中，为了减少需要分析的样品数量，需要对孵育后的混合底物进行正相或负相的离子化。使用高流速和亚 2 微米填料色谱柱的快速液相色谱方法可以减少分析时间并提高分析通量[1, 2]。通常采用串联四极杆液质联用仪及多反应监测模式（MRM）进行检测分析。盒式分析的目的是，将能在正离子模式或负离子模式下底物组分混和在一起进行液质分析。其原因在于,对于快速液相色谱得到很窄的色谱峰，质谱分析如果无法以足够快的速度对单个峰采集到九至十个数据点，那么就无法保证定量数据的准确度。然而，将能在正离子模式或负离子模式下底物组分混和在一起仍然显现了其灵活性的优点。本项工作介绍了几种技术联用的优点，不仅使用盒式分析和快速液相色谱，而且利用快速极性切换的 MS / MS 分析以提高分析效率和在代谢物稳定性研究中的灵活性, 同时保证良好的准确度和精度。而且，安捷伦 1290 Infinity LC的流量范围达 2 毫升/分钟时其泵压力可以达到 1200 bar，这保证了临界峰之间的良好分离度。

实验化学试剂和备件盐酸维拉帕米购自 SigmaAldrich (St. Louis, MO USA)。右美沙芬(Dextromethorphan), 双氯芬酸(diclofenac)和去甲右美沙芬-d3 (内标) 购自 Cerilliant (RoundRock, TX USA)。氘代 d4-双氯芬酸(苯基氘代d4) 购自 CDN Isotopes (Quebec, Canada)。还原型辅酶 II（NADPH）再生系统，溶液 A (b-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐 (NADP), 葡萄糖-6-磷酸和氯化镁水溶液)和溶液 B (葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的 5 mM 柠檬酸钠溶液)以及.5 M 磷酸钾溶液, pH 7.4 购自 BD Biosciences。其它的试剂盒有机溶剂都是分析级并购自 VWR。

鼠肝的底物的孵育 S9 馏分第一阶段代谢（phase I metabolism）的孵育混合物由相当于 0.3 mg 蛋白质的 S9 组分，1 µM底物（盐酸维拉帕米，右美沙芬或双氯芬酸，它们是用浓度为 100 µM 储备液经70%水/ 30%乙腈制备而来），1.3 mM 的 b-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐 (NADP)，3.3 mM 葡萄糖-6-磷酸，3.3 mM 氯化镁溶液和0.1 M 磷酸缓冲液配制的 0.4 U/mL 的葡萄糖6-磷酸脱氢酶（pH 7.4)，制备成总体积为 300 µL的溶液。在 37°C 下进行孵育。孵育后制成四种底物的混合溶液以降低分析时间。取 25 µL0, 5, 10, 15, 25 和 35 min 时的孵育液，用 300 µL含有去甲右美沙芬-d3 和氘代 d4-双氯芬酸的乙腈溶液停止反应，然后在 14000 g 下离心 10 分钟。取上清液，然后缓缓地用氮气吹干。用含0.1%甲酸的水/乙腈（80/20 v/v）的溶液再溶解，用于 UHPLC/MS/MS 分析。仪器Agilent 1290 Infinity 液相色谱配置：• 1290 Infinity 集成脱气机的高压二元泵, 1290温控自动进样器和 1290 柱温箱• Agilent 6460A 喷射流离子聚焦三重串联四极杆液质联用仪• Agilent MassHunter 质谱工作站用于数据的采集和处理• Agilent MassHunter Optimizer 方法优化软件• Agilent Zorbax SB-C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm色谱柱

Agilent 1290 Infinity 液相色谱分析方法流动相为:A 相: 含 0.1%甲酸的水溶液B 相: 含 0.1%甲酸的乙腈溶液进样体积: 1 µL洗针: 在洗针座用含 0.1%甲酸的甲醇水（50/50 v/v）溶液洗针 20 秒UHPLC 方法 1:柱温: 25°C 或 40°C流速: 1.0 mL/min梯度: 25% B 保持 0.2 min, 在 1 min 80% B, 在1.25 min 80% B, 在 1.26 min 25% B, 停止时间：1.8 minUHPLC 方法 2:柱温: 60 °C流速: 1.5 mL/min梯度: 25% 保持 0.2 min, 在 0.73 min 80% B, 在1.00 min 80% B, 在 1.01 min 25% B, 停止时间：1.5 minAgilent 6460A 三重串联四极杆液质条件：扫描模式: 多反应监测模式(MassHunter 优化软件帮助您快速获得最佳的碰撞电压和碰撞解离能量，已经优化好的质谱参数参见表 1, 2和 3)极性：正/负切换模式，正模式或负模式参 数：干 燥 气温度： 350°C, 干 燥 气流速 :10 L/min, 鞘流气温度: 400°C 鞘流气流速:12 L/min, 雾化器压力: 35 psig, 锥口电压: 0 V (+)1000 V (-), 毛细管电压: 4,000 V (+/-)正负切换速度: 30 ms

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结果与讨论快速极性切换模式下采集速度和数据结果的质量在高流速（1.0 mL/min 或 1.5 mL/min）和高压（至 1,100 bar）的条件下的超高性能液相色谱分离，分离时间仅需 1.5 min，但组分的半峰宽小于 1 秒（一般是 0.4 至 1.0 sec)。由于质谱分析具有很低的循环时间，所以针对每个峰能采集到足够的数据点(> 9 数据点)，这样就保证了定量结果的精确度(峰面积 RSD [%] 和相对峰面积 RSD [%] = 目标组分的峰面积/ 内标组分的峰面积，相对标准偏差 < 10%)。图 1 是流速在1.5 和 1.0 mL/min 条件下，MRM 离子流图，数据质量和分析时间的结果比较。如果要得到好的定量分析结果，则要求每个峰需要 9-10 个数据点。组分峰越窄，质谱检测器就需要具有越高的采集速度。质谱分析的周期被缩短。在每个循环周期内，质谱需要采集在正负切换下的 6 个 MRM transitions。图 2 是 30ms 的正负切换速度和 114 ms 的循环时间周期的条件下双氯芬酸的分析结果。图中显示组分峰的半峰宽 0.37 sec，每 个峰的数据点是9 个，所以峰面积和相对峰面积的精度很好，分别是 4.8 和 7.9%。