用高分离度快速液相色谱对三七进行快速、 高分离度分析

摘要：本应用报告内容： • 建立了三七分析的高分离度快速液相色谱(RRLC)方法 • 从常规 HPLC 到 RRLC 的方法转换结果 • RRLC 方法的使用缩短了分析时间，同时保持了复杂组分的良好分离度，从而提高 了样品通量，降低了成本 • 采用优化的方法得到了三七植物不同部位的色谱图，结果显示其峰形和特定皂甙的 浓度各不相同

前言 中药（TCM）在中国已有很长的历史， 其疗效被中国、韩国、日本等亚洲国家 广泛认可。西方国家也越来越普遍地将 中药作为食品添加剂或营养品。随着时 间的推移，已有 11000 多种中药曾被使 用。中药的研究和质量控制十分依赖于 仪器分离，并要求很高的分离性能。 在本研究中，我们建立了一种分析三七 的高分离度快速液相色谱(RRLC)方法。用 安捷伦的方法转换器可以将常规 HPLC 方法轻松转移至 RRLC。用不同的提取方 法制备三七植物不同部位的样品。将这 些样品用优化的方法进行分离，得到的 色谱图显示其具有不同的色谱峰形。本 应用报告还显示了定量结果。质量控制 部门可以利用本研究开发更快、更好的 方法，缩短分析时间、提高样品通量。 使用该方法还降低了溶剂成本，改善了 整个分析流程。 三七，在中国也称田七，是一种重要而 昂贵的中药。已栽培了约 400 年，85% 以上的三七产自中国的云南省。三七的 疗效主要有活血化瘀、消肿止痛。最新 的 药 理 学 研 究 表 明 ， 三 七 （ Panax notoginseng）具有抗癌和保肝作用，对 心脑血管系统也有保护作用［1］。三七的 皂甙图谱与著名的人参(Panax ginseng) 和西洋参(Panax quinquefolium)非常相 似，因为它们属于同一种属。三七主要用 于中国南方，有多种不同的中药剂型。著 名的中药制剂云南白药和片仔癀都含有 三七。 中药基质的复杂一直是质量控制和研究 的最大挑战。中国药典 2005 版列出了药 材三七和中国药物三七伤药片，必须 对制剂中的三七皂甙 R1 成分进行分析。 三七皂甙的一般分析时间为 60 分钟以上。 随着对中药的研究越来越深入，科学家们 认为仅控制一两种组分还不足以确定中 药的质量，需要开发分离更多组分的质量 控制方法。分离像中药这样的复杂样品比 分离合成药物需要更多的时间。当样品通 量也纳入考量范围的时候，理想的解决方 案就是用更短的时间得到相似或更好的 性能。采用 RRLC 可以开发分析时间更短、 性能更好的方法。RRLC 方法还有节省时 间和溶剂的优势。对生产质量控制来说， 使用 RRLC 意味着新批次的产品可以比用 常规 HPLC 方法更快出厂。

实验部分 仪器 用配置以下组件的 Agilent 1200 系列高 分离度快速液相色谱系统开发 RRLC 方 法： Agilent 1200 系列 RRLC 系统包括： • 带真空脱气机的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵 • Agilent 1200 系 列 SL 型 高 效 自 动 进 样器 • Agilent 1200 系列 SL 型柱温箱 • Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检 测器，配备微量流通池（2 µL 体积，3 mm 光程） • Agilent 化学工作站 B.02.01 SR1 ，用于 数据采集和处理 • Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT 色谱 柱，4.6 x 50 mm，1.8 µm 粒径 用包含以下组件的标准配置 Agilent 1100 系列液相色谱仪进行常规 HPLC 对比 实验： • 带脱气机的 Agilent 1100 系列二元泵 • Agilent 1100 系列自动进样器 • Agilent 1100 系列柱温箱 • Agilent 1100 系列二极管阵列检测器 • Agilent ZORBAX SB-C18 色 谱 柱 ， 4.6 x 50 mm，5 µm 粒径

样品和样品制备 • 三七皂甙 R1、人参皂甙 Rg1 和人参皂 甙 Rb1 标准品购自中国药品生物制品检 定所(NICPBP)。人参皂甙 Re 和人参皂 甙 Rc 标准品购自美国 Sigma-Aldrich 公司 • 三七茎和叶提取物 (NCLE)由用户实验 室友情赠送。茎和叶用 60%乙醇萃取， 溶剂蒸干后，用正丁醇溶解残渣，再将 溶剂蒸干，残留黄色粉末用甲醇溶解， 进样 • 三七根提取物 (NRE)由用户实验室友情 赠送。原始组分用水提取，经大孔滤膜 过滤后，蒸干。残留白色粉末用甲醇溶 解，进样 • 三七购自当地药材商店。品牌为同仁堂。 原料用水/甲醇 (30/70，v/v)提取，超声 处理 30 分钟，用 0.22 µm 滤膜过滤，用 澄明滤液进样 • 水、乙腈和甲醇均购自美国 Fisher 公司

方法转换 使用 5 µm 粒径填料色谱柱的常规 HPLC 方法需要转换为使用 1.8 µm 粒径填料色 谱柱的 RRLC 方法。安捷伦的方法转换器 （在 Agilent 1200 系列高分离度快速液相 色 谱 系 统 的 光 盘 上 ， 出 版 号 5989- 5130EN）可用于这一目的，转换过程简 便、快速（图 1）。根据不同情况，转换 后的方法可能需要按方法转换器上列出的 不同参数做进一步调整。如何将常规 HPLC 方法手动转换成 RRLC 方法，可查 阅安捷伦的其它应用报告[2,3,4] 。

结果与讨论 色谱图 药理研究结果表明，由于组分不同，三 七植物的不同部位有不同疗效。为了获 得更多有效的成分，我们采用了各种特 殊提取方法。三七样品用常规 HPLC 方 法和 RRLC 方法分析得到了不同的峰形图。 图 2 显示了用常规 HPLC 方法分析的三 七茎和叶提取物（NCLE）的色谱图。通 常此类分离需要 60 分钟以上[5] 。如实验 部分所述，分析三七样品的 RRLC 方法是根据常规 HPLC 方法开发的。同样的 NCLE 样品分别采用常规 HPLC 方法和 RRLC 方法 1。色谱图见图 2 和图 3。图 3 的色谱峰比图 2 的峰窄，这说明提高了 复杂样品的峰容量。RRLC 分析的分离度 或分离性能比常规 HPLC 更好。同时分 析时间从 60 分钟缩短到 20 分钟。另一 个应当关注的因素是常规 HPLC 和 RRLC 的色谱柱选择性应保持一致。如果新 RRLC 柱具有和常规 HPLC 柱不同的 选择性，转换方法将失去意义。本研究中 的峰形和洗脱顺序都相同，因而没有必要 再确认新色谱图中的色谱峰。另外，二极 管阵列检测器的 UV 光谱图也有助于进一 步确证。

图 4 显示了用 RRLC 方法 2 分析 NCLE 样 品 所 得 的 色 谱 图 。流 速 提 高 到 1.5 mL/min，缩短了分析时间。同时还保持 了与图 3 结果相同或相当的性能。对于 复杂样品，缩短分析时间意味着损失峰容 量。因此，用户应权衡峰容量和分析时间 做出选择。 如实验部分所述，三种样品取自不同部位。 图 5 为用 RRLC 方法 1 分析三七根提取 物（NRE）样品的色谱图。该样品采用不 同的步骤从三七根中提取的。色谱峰形显 示 NRE 和 RCLE 含有不同种类的皂甙和 其它成分。为了检验我们建立的 RRLC 方 法能否用于其它三七样品的分析，我们在 当地中药店购买了三七，品牌为同仁堂， 药店已经把这种三七制成了粉末。对该三 七样品分析的色谱图见图 6 和图 7。图 6 中的色谱图为采用 RRLC 方法 1 所得，图 7 采用的是 RRLC 方法 3。与需要 60 分 钟以上分析时间的常规 HPLC 方法相比， 图 7 中的色谱图显示 4 分钟即可完成分 析。三七茎和叶提取物比所分析的其它样 品更复杂，使用 RRLC 方法 1 或 2 在保 证分离度的同时节省了分析时间。对于像 同仁堂三七提取物这样不太复杂的样品， 可以用更快速方法在较短的时间内完成分 析，如图 7 所示。

定量结果 用 RRLC 方法 2 分析了实验部分列出的 标准品。采用不同浓度的标准品建立校正 曲线，测定三个样品的浓度。定量结果见 表 2。NCLE 含有许多种类的皂甙，但不 含 Rc 或 Re。NRE 含皂甙的种类较少， 但却包含了本研究所分析的 5 种标准品。 同仁堂三七提取物不含多种皂甙，也不含 Rc 或 Re。R1、Rb1 和 Rg1 的含量高于 NCLE 和 NRE。所有样品中三七 R1 的浓 度为 0.029 到 0.89 µg/µL。本研究中建立 的定量方法可用于对不同方法提取的三 七进行质量控制。

结论 中药是复杂的天然产物，用常规 HPLC 方法分析需要高性能的系统和较长的分 析时间。本研究所建立的 RRLC 方法显示 了如何在保持复杂组分良好分离度的同 时缩短分析时间。色谱图显示不同三七提 取物样品有不同的色谱峰形。如果将应用 需求考虑在内，还可以采用更快流速的 RRLC 获得更快速的分析方法。本研究中 所建立的定量方法可轻松用于三七产品 的质量控制。采用 RRLC 方法保持或提高 了性能，同时大大缩短了分析时间，从而 增加了样品通量、降低了成本。