高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸！

高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸！

金银花FlosLonicerae又名忍冬、双花，为临床常用中药，具有清热解毒、凉散风热之功效，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等。在中成药中，金银花或以细粉直接入药，或以提取物的形式入药，但大部分制剂以后者的形式入药。

目的建立金银花提取物中绿原酸含量的HPLC测定方法。方法国产C18柱（4.6mm×250mm，7μm）；流动相为乙腈：0.4%磷酸（12∶88）；检测波长为327nm；流速1ml·min-1；进样量10μl；柱温25℃。结果绿原酸在0.0716～0.6444μg范围内线性关系良好，r=0.9996；平均回收率99.99%，RSD=1.61%（n=6）。结论该方法简便、快速、准确，可用于金银花提取物的含量测定及质量控制。

金银花入药有两种形式，一是以全草直接投料，煎煮入药，即以煎煮液（即药材的提取液）作为半成品（中间体）；另一种是先提取有效部位，而后以提取物投料，即以提取物作为中间体（原料）（刘艳娥《第二军医大学硕士学位论文》）。为了有效控制金银花提取物（中间体）的内在质量，本实验参考了有关文献及2005版《中国药典》方法，采用高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸含量。

1、仪器与试药

Agilent1100series高效液相色谱仪（G1322A排气阀，G1311A泵，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器），chemistation色谱工作站，KromasilC18色谱柱，超声提取器（KQ3200DE型数控超声仪昆山市超声仪器有限公司）；绿原酸对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号110753-200212），金银花提取物（本实验室自制），乙腈，磷酸均为分析纯；水为双蒸水。

2、方法与结果

2.1分析方法的建立——分离及检测条件的选择2.1.1色谱条件色谱柱为国产KromasilC18柱（250mm×4.6mm，7μm）；柱温25℃；流动相为乙腈-0.4%磷酸（12∶88）；流速为1ml·min-1；检测波长327nm。

2.2pH值对峰形的影响绿原酸属于有机酸类物质，在HPLC测定时易发生前沿或拖尾峰，流动相加入酸可以改善这种现象。本实验比较了水、乙酸、磷酸对峰形的影响，当选用0.4%磷酸时，可得到较好的色谱峰形。

2.3色谱系统适应性实验在选定条件下，绿原酸和样品中其他组分可基线分离，绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数（N）为5000以上。

a-对照品b-供试品2.2对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液，即得。2.3供试品溶液的制备精密称取本提取物10mg，置100ml容量瓶中，双蒸水溶解，超声2min后，再用双蒸水定容至刻度，摇匀，过0.45μg微孔滤膜，取续滤液即得。

2.4线性范围的考察及其标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液2，4，6，10，14，18μl，分别注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（A）对进样量进行回归，得回归曲线方程：Y=2468.4X-16.205，r=0.9996。结果表明，绿原酸在0.0716～0.6444μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5精密度实验精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复进样6次，记录各组绿原酸峰面积值，结果平均峰面积为：840.5，RSD为0.69%（n=6）。

2.6稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8h进样10μl，测得绿原酸的平均峰面积值为：680.24，RSD为：0.38%（n=5），表明供试品溶液在8h内稳定。

2.7重复性实验取同一批号（070204）样品6份，按含量测定方法测定，结果绿原酸平均含量为28.01%，RSD为1.07%（n=6）。

2.8加样回收率实验精密称取已知含量的金银花提取物6份，分别精密添加绿原酸对照品适量，按供试品溶液的方法制备，测定，计算回收率。

2.9样品测定取3批样品，按照上述方法制备供试品溶液，进样10μl，依照已确定的色谱条件测定，按峰面积值用外标法计算样品中绿原酸的含量。

3、讨论

金银花提取物以有机酸为有效成分，本实验以绿原酸含量作为金银花提取物的质量控制指标，同时测定了3批金银花提取物中绿原酸的含量，通过计算，其含量均在20%以上。本文所建立的方法简便、快捷，重复性及稳定性均较好，可在实际生产中用于该提取物的质量控制。本文所做的工作为开发金银花的相关产品提供了质量监控方法。

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