使用二维液相色谱分析饲料中的 维生素 A、D3、E

摘要本文介绍了使用二维液相色谱同时检测饲料中维生素 A、D3、E 的分析方法。前处理使用安捷伦表面亲水反相苯乙烯二乙烯基苯聚合物 Bond Elut Plexa 对饲料碱性皂化液进行富集和净化，方法简单，高效、环保。在相应的浓度范围内，维生素 A、D3、E 的线性相关系数均大于 0.999。5 种饲料在不同的加标浓度下，维生素 A、D3、E 的平均加标回收率分别在 91.9%–112.1%、87.4%–122.9% 和 89.4%–116.7% 之间，相对标准偏差分别在1.0%–11.5%、0.2%–10.5% 和 0.9%–9% 之间，准确度和精密度良好，该方法适用于同时检测饲料中的维生素 A、D3、E。

前言脂溶性维生素 A、D、E 作为一类有机微量营养物质，有促进动物生长、调节代谢和增强动物免疫等作用。通常情况下，畜禽不能或难以合成满足自身需要的足量维生素，因此需要在饲料中添加适量维生素，以满足养殖业对于饲喂畜禽快速、健康生长的需求[1]。中华人民共和国农业部公告第 2625 号公告[2] 制定了饲料中维生素的推荐用量和最高用以指导饲料生产企业根据畜禽品种和不同生长阶段调控维生素的添加量。根据现行的国家标准，维生素 A、D3、E 的检测是分开的三个标准[3-5]，检测成本较高，耗时且工作量大。因此，有必要建立一种可以同时检测维生素A、D3、E 的方法，实现饲料中脂溶性维生素含量的准确测定，对饲料中维生素含量进行监控，掌控饲料中含量，使其可以既满足畜禽营养需求，又符合国家规范要求。饲料中维生素 A、D3、E 的前处理方法，通常包括皂化、提取和浓缩等步骤，皂化的主要目的是将维生素从制剂包被的状态中游离出来同时将酯形式的维生素水解为醇便于检测，皂化步骤通常是一步。对于提取和浓缩，一般有液液萃取和固相萃取两种方法，传统的液液萃取方式采用石油醚，相比于液液萃取消耗溶剂量大，环境不友好，耗时的缺陷而言，固相萃取具有节省溶剂，集净化和浓缩于一体且能实现良好的净化效果等优势。Agilent Bond Elut Plexa SPE 柱，是表面羟基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料，易被水润湿且流速优异，可耐受高pH，是比较理想的选择。对于仪器方法，维生素 A、E 可使用一维 DAD 检测，而维生素 D3 添加量较低，灵敏度有限且易受基质干扰，是制约维生素 A、D3、E 同时检测的难点所在。二维液相色谱具有自动化程度高且峰容量大，可显著降低复杂样品的基质干扰等特点，已得到广泛的应用，安捷伦目前已经有多篇关于食品中维生素 A、D、E 同时检测的应用[6-9]，其中包括在线 SPE-2D中心切割法对皂化液进行自动净化，富集，以及维生素 A、D、E 的同时分析。本文在此基础上，使用 Agilent Bond Elut Plexa离线固相萃取方式对皂化液进行净化和富集，并结合二维液相色谱，建立了同时检测饲料中三种脂溶性维生素 A、D3、E 含量的方法，为用户提供更多，更灵活的方法选择。

实验部分试剂和样品实验用乙腈、甲醇均为色谱纯，购于北京迪马科技有限公司；无水乙醇、氢氧化钾、L-抗坏血酸、二丁基羟基甲苯 (BHT) 为分析纯。维生素 A、维生素 A 乙酸酯、维生素 E、维生素 E 乙酸酯和维生素 D3 标准品购于曼哈格公司 (BePure)。饲料样品为市售产品。标准品制备称取一定量上述标准品，以甲醇为溶剂，配制于棕色试剂瓶中，密封后避光储存于 –18 °C 下。临用前将储备溶液回温至室温，参考国标方法进行浓度校正。

仪器和设备仪器具体配置如下：Agilent 1260 Infinity II 泵（第一维泵，部件号 G7111；第二维泵，部件号 G1312B）；Agilent 1260 InfinityII 自动进样器（部件号 G7129A）；Agilent 1260 Infinity II 柱温箱（部件号 G7116A）； Agilent 1260 Infinity II VWD（部件号G7114B，第一维检测器）Agilent 1260 Infinity II DAD 检测器（G7117C，第二维检测器）。色谱柱采用 Agilent Poroshell HPH-C8（4.6 × 50 mm, 2.7 µm，部件号 699975-706）、Poroshell 120 EC-C18（4.6 × 5 mm, 2.7 µm，部件号 820750-911）和 Zorbax Eclipse PAH（2.1 × 100 mm,3.5 μm ，部件号959793-918）。样品前处理采用 Agilent Bond Elut Plexa（200 mg，6 mL；部件号12109206）、Agilent ValueLab 尼龙微孔滤膜（0.2 μm，13 mm；部件号 5191-4286）。

维生素标样制备准确取适量维生素 A、D3、E 标准工作液，用乙腈配制系列标准溶液，其中维生素 A 的浓度分别为 0.2、0.5、1、5、10、20、50 IU/mL，维生素 D3 的浓度分别为 0.1、0.5、1、5、10、50 IU/mL，维生素 E 的浓度分别为 0.0005、0.001、0.005、0.05、0.1、0.2、0.5 IU/mL，临用现配。

样品前处理称取一定量饲料样品，加入乙醇和氢氧化钾溶液皂化后使用Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱对皂化液中维生素 A、D3、E进行富集和净化，用二维液相色谱测定，如图 1 所示为样品前处理操作流程，表 1 所示为液相色谱分析条件。

结果与讨论Bond Elut Plexa 固相萃取条件优化Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱，是表面羟基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料，能够耐受皂化液的强碱条件，易被水润湿且流速佳，适合饲料皂化液中富集和净化维生素 A、D3、E。为了确定最佳的固相萃取条件，本应用从淋洗溶剂（5%、10%、20%、40%、50% 甲醇水）、洗脱溶剂（乙腈、甲醇、乙酸乙酯）和洗脱体积（2 mL、3 mL、4 mL）三个方面对固相萃取条件进行优化。采用饲料皂化液加入适量的维生素 A、D3、E 标样的方法，分别采用上述不同的淋洗溶剂、洗脱溶剂和洗脱体积做相应的处理（在确定最佳的条件之前，均使用 10% 甲醇水淋洗和4 mL 乙腈洗脱的条件），结果分别见图 2A、2B。由图可知，使用不同的淋洗溶剂，回收率结果没有明显差异，但考虑到上样皂化液中含有高浓度的氢氧化钾溶液，采用高比例水淋洗有更佳的去除效果，因此选择 10% 甲醇水溶液作为淋洗溶液。对于不同的洗脱溶剂，乙腈对维生素 A、D3、E 的洗脱效果优于甲醇和乙酸乙酯。因此进一步比较确定了乙腈的使用量，使用 3 mL 即可将维生素 A、D3、E 洗脱，最终确定了使用 10% 甲醇水淋洗，并使用 3 mL 乙腈洗脱。