液相色谱系统对饲料中的辣椒玉红素和辣椒红素进行分析

摘要：本文介绍了使用 Agilent Poroshell 120 EC-C8 反相色谱柱结合 Agilent 1200 液相色谱系统测定饲料中辣椒玉红素和辣椒红素的分析方法。在 0.01-5 μg/mL 的浓度范围内，两种目标化合物的相关系数均高于 0.99，表明该方法具有良好的线性。方法定量限为 100 μg/kg，检测限为 50 μg/kg。在加标浓度为 100–500 μg/kg 时，肉中鸭饲料中两种目标化合物的平均加标回收率和相对标准偏差分别在 83.3%–106.0% 和 1.0%–6.5% 之间，表明该方法具有出色的准确度和精密度，适用于测定饲料样品中的辣椒玉红素和辣椒红素残留。对两种市售饲料添加剂样品进行方法干扰测定考察，结果表明目标化合物峰处无干扰峰，可实现准确定量。

前言辣椒玉红素和辣椒红素是辣椒红色素中极性较大的红色组分，占总量的 50%–60%，其结构和性质见表 1。它们从成熟的红辣椒中提取，安全无毒且性状稳定，着色性好，在肉类、糕点、饮料等食品工业中有着广泛应用。另外，将其添加于饲料中，可通过在动物皮肤、脂肪等不同组织中沉积而使肉禽及水产品着色，例如添加到鸡、鸭饲料中可显著改善蛋黄色泽，因此在饲料领域中也有广泛的应用[1]。目前针对辣椒玉红素和辣椒红素的高效液相分析方法多为正相色谱法，需要使用丙酮和正己烷等试剂，并且在正相模式下需要对常规使用的反相液相色谱仪器配件进行更换。本应用使用 AgilentPoroshell 120 EC-C8 反相色谱柱并结合 Agilent 1200 高效液相色谱系统，建立了用于饲料和饲料添加剂中辣椒玉红素和辣椒红素的高效液相分析方法。

实验部分试剂和样品实验用甲醇、乙腈均为色谱纯，购于北京迪马科技有限公司；实验用水为娃哈哈纯净水；辣椒玉红素和辣椒红素标准品浓度均为100 µg/mL，购于成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，以乙腈为溶剂；饲料和饲料添加剂样品均为市售产品。仪器和设备采用 Agilent 1200 液相色谱系统，其配备 Agilent 1260 DAD 检测器（货号 G4212B）、Agilent 1200 TCC SL 柱温箱（货号 G1316B）、Agilent 1200 Hip-ALS LS 自动进样器（货号 G1367D）和 Agilent1200 BI-PUMP 二元泵（货号 G1379B）。色谱柱选用 Agilent Poroshell 120 EC-C8（3.0 × 100 mm，2.7 μm；货号 695975-306）。样品前处理采用 Agilent Captiva RC 微孔滤膜（0.2 μm，13 mm；货号 5190-5108)、Agilent ValueLab 尼龙微孔滤膜（0.2 μm，13 mm；货号 5191-4286）和安捷伦陶瓷均质子（用于 50 mL离心管；货号 5982-9313）。

标准品制备分别取适量的标准品用乙腈配制浓度为 10 μg/mL 的混合标准工作液，备用。校准标样的配制：分别准确移取上述适量混合标准工作液，用80% 乙腈水溶液稀释得到浓度分别为 0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1 和 5 μg/mL 的系列校准标样，现配现用。样品前处理称取样品 2 g（精确至 0.01 g）于 50 mL 离心管中；加入 10 mL乙腈，涡旋振荡 5 min；以 8000 r/min 离心 5 min；取 800 μL 上清液，加入 200 μL 水；过 0.2 μm RC 微孔滤膜，待测。

液相色谱条件色谱柱： Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 µm进样量： 10 μL流速： 0.5 mL/min柱温： 40 °C流动相： A) 水 B) 乙腈梯度程序： 时间 (min) B (%) 0.0 75 1.0 100 6.0 100后运行时间 5 min检测器： DAD，波长 474 nm，带宽 4 nm；参比 360 nm，带宽 100 nm

结果与讨论液相色谱柱的选择本应用考察了两种具有相同规格的反相色谱柱：Poroshell 120EC-C8 和 EC-C18，在上述流动相条件下得到的辣椒玉红素和辣椒红素的色谱图，如图 1 所示。从图中可以看出，与 EC-C8 色谱柱上的结果相比，辣椒红素在 EC-C18 色谱柱上的保留更强，色谱峰和杂质峰未得到有效分离且响应较低，这与其 LogP 值较大有关。而使用 EC-C8 色谱柱时，辣椒玉红素和辣椒红素峰与杂质峰均能得到很好地保留和分离，峰形尖锐且对称。最终采用 Poroshell 120 EC-C8 色谱柱，并在上述液相条件下连续进样6 针， 结果发现峰面积和保留时间的重复性均良好。

结论本研究将 Poroshell 120 EC-C8 色谱柱与 Agilent 1200 液相色谱系统相结合，建立了一种定量测定饲料和饲料添加剂中辣椒玉红素和辣椒红素的分析方法。使用短碳链键合的 Poroshell 120 EC-C8 色谱柱相比于 C18 键合相，能够使辣椒玉红素和辣椒红素获得更好的保留和分离，得到对称、尖锐的峰形，且重复性优异。使用外标法定量，该方法在 0.01-5 μg/mL 的浓度范围内表现出良好的线性，线性相关系数高于 0.99。使用乙腈对饲料样品进行提取，在加标浓度为 100、 200 和 500 μg/kg 时，目标化合物的平均回收率在 83.3%–106.0% 之间，且相对标准偏差在 1.0%–6.5% 之间，表明该方法具有良好的准确度和精密度。方法的检测限为 50 μg/kg，定量限为 100 μg/kg，具有出色的灵敏度。同时对两种市售饲料添加剂样品进行检测，在本应用建立的色谱条件下获得了良好的峰形且目标峰处无干扰峰存在。因此，本文所述的方法适用于饲料中辣椒玉红素和辣椒红素的测定。