利用未衍生化氨基酸的LC/MS 分析 进行生物反应器细胞培养监测

摘要 ：本应用简报介绍了发酵培养基中氨基酸 LC/MS液质联用分析的解决方案。氨基酸的极性使其 难以进行反相液相色谱分析，因此通常使用衍生化来改善其保留能力。然而，亲水 相互作用色谱 (HILIC) 无需衍生化也能保留并分离复杂的氨基酸混合物，同时还具有 与传统反相液相色谱类似的工作流程。HILIC 与质谱的组合提供了一种极其简单而功 能强大的未衍生化氨基酸分析解决方案。

前言： 监测生物反应器和发酵培养基中发现的各种极性化合物，是亲 水相互作用色谱 (HILIC) 的一种挑战性实际应用。使用高 pH 条件与负离子模式 LC/MS 检测，可以在一次分析中实现对氨 基酸、原料与废弃物的监测。Agilent AdvanceBio MS Spent Media 的键合相在高 pH 流动相下具有出色的稳定性，非常适 合该体系的分离。 尽管基质的分析充满挑战性，进样间的重现性仍十分优异。中 空纤维反应器和转瓶反应器的检测结果揭示了培养细胞的葡萄 糖和氨基酸消耗以及乳酸分泌。

实验部分：试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC 级或更高等级。超 LC/MS 级乙腈购自 J.T. Baker (Center Valley, PA, USA)。水的净化处理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系统 (Darmstadt, Germany) 完成。试剂级甲 酸（FA，部件号 G2453-85060）来自安捷伦科技公司。甲酸 铵、乙酸铵、氢氧化铵和氨基酸标样购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。DMEM 培养基购自赛默飞 (Waltham, MA, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下储存。 仪器与材料 • Agilent InfinityLab 接头 • 色谱柱前端：Agilent Quick Connect 快速连接接头 （部件号 5067-5965） • 色谱柱末端：Agilent Quick Turn 接头（部件号 5067- 5966） • 安捷伦样品瓶，螺口盖，棕色，带书写签，已认证， 2 mL，100/包（部件号 5182-0716） • 安捷伦固定螺口盖，PTFE/红色硅橡胶隔垫（部件号 5190-7024） • 安捷伦样品瓶内插管，250 µL，去活玻璃，带聚合物支脚 （部件号 5181-8872） • Eppendorf 移液器和连续分液器 • 超速离心仪 (VWR, Radnor, PA, USA) • 涡旋仪和多管涡旋仪 (VWR, Radnor, PA, USA) • HDPE 溶剂瓶 (VWR, Radnor, PA, USA) • 转瓶生物反应器 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) • 中空纤维生物反应器 (FiberCell Systems, New Market, MD, USA)

仪器 • Agilent 1290 Infinity II 二元泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II 样品瓶进样器 (G7129B) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 液相色谱系列超低扩散工具包 (5067-5189) • Agilent 6545 四极杆飞行时间 (Q-TOF) 质谱仪 • 安捷伦喷射流电喷雾离子源 软件 Agilent MassHunter 工作站软件 B.08.00 样品前处理 将细胞培养样品用 50% 乙腈稀释 4 倍，并以 10000 × g 的速度 离心 10 分钟。收集上清液并进样，无需进一步样品前处理。 流动相 用水配制 100 mM 乙酸铵储备液，并用氢氧化铵将 pH 调节至 9。 将水与储备液按 9:1 稀释制得流动相 A。将乙腈与储备液按 9:1 稀释制得流动相 B。两种流动相的乙酸铵终浓度均为 10 mM。 流动相与玻璃器皿过度接触会引入离子物质，干扰并抑制质谱 检测。储存在玻璃瓶中的流动相应定期更换，或转移至 HDPE 瓶中。

结论：Spent 培养基中的氨基酸在 HILIC-MS的负离子模式下成功得 到了分析。通常难以分析的亮氨酸/异亮氨酸同量异位素实现 了基线分离，分离度为 1.6。氨基酸作为两性离子，在正离子 和负离子模式下都容易电离，但在高 pH 负离子模式下能够实 现对细胞培养基、原料和细胞废弃物的同时监测。